耐辐射奇球菌TAT-PprI蛋白对小鼠急性放射损伤防治作用及其机理的研究

摘要

目的：耐辐射奇球菌是目前地球上辐射抗性最强的原核生物之一。该菌极端的辐射抗性与其DNA损伤应答（DDR）和修复系统的蛋白表达密切相关，其中PprI蛋白是一种关键的修复蛋白调控因子。本课题组近年的研究表明，耐辐射奇球菌pprI基因转染对人离体细胞和哺乳动物急性放射损伤具有非常显著的辐射防治作用，表明该原核蛋白可能成为高等真核生物放射损伤的一种有效的辐射防护药物。在此基础上，我们成功地在大肠杆菌、毕赤酵母菌中高效表达并分离出PprI蛋白，并证实PprI蛋白和具有TAT跨膜结构的PprI蛋白（TAT-PprI蛋白）对受致死剂量照射的人离体细胞具有显著的抗辐射作用。然而，真核系统表达的耐辐射奇球菌TAT-PprI蛋白对哺乳动物急性辐射损伤的防治作用及其机理迄今尚未见国内外报道。因此，本课题主要深入研究TAT-PprI蛋白对哺乳动物急性辐射损伤防治作用及其机理，为急性放射损伤的临床应用提供厚实的实验资料。
　　材料与方法：本实验对本课题组保存的含有pHBM905A-His-PprI载体和pPICZαA-TAT-PprI载体的两种毕赤酵母菌株进行培养，以便获得大量真核系统表达的耐辐射奇球菌PprI蛋白和TAT-PprI蛋白。将纯化的PprI蛋白和TAT-PprI蛋白注入纯品种BALB/c小鼠体内，以生理盐水注射组小鼠作为对照组，应用γ射线照射，观察受照小鼠的体重变化、血细胞计数、血生化及存活率；观察受照小鼠肝脏、肺脏、小肠、睾丸组织的病理学变化；应用小动物成像仪观测TAT-PprI蛋白在小鼠体内的分布；应用流式细胞仪检测受照小鼠骨髓细胞和脾脏淋巴细胞的凋亡率；应用抗氧化试剂盒检测受照小鼠肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量变化。
　　结果：
　　1.成功获得了大量纯化的真核系统表达的耐辐射奇球菌PprI融合蛋白和TAT-PprI融合蛋白。
　　2.PprI蛋白注射剂量筛选结果小鼠受照后第7天，当PprI蛋白注射剂量为600ug/kg时，小鼠体重恢复较快，外周血白细胞、淋巴细胞及血小板计数分别为1.07×109/L、0.71×109/L、164.33×109/L，显著高于对照组（P<0.05)；骨髓细胞凋亡率及脾淋巴细胞凋亡率分别为6.92％、30.38%，显著低于对照组（P<0.05)。
　　3.TAT-PprI蛋白注射剂量筛选结果小鼠受照后第7天，当TAT-PprI蛋白注射剂量为800ug/kg时，小鼠体重恢复较快，外周血白细胞、淋巴细胞及血小板计数分别为0.84×109/L、0.18×109/L、178.67×109/L，显著高于对照组（P<0.05)；骨髓细胞凋亡率为31.41%，显著低于对照组（P<0.05)；脾淋巴细胞凋亡率与对照组比较无明显差异（P＞0.05）。
　　4.小鼠辐射死亡率的变化小鼠受照后，死亡多集中在10~20天，照前及照后蛋白注射组在照后30天内小鼠死亡率分别为50%和70%，明显低于生理盐水注射组90%的死亡率。
　　5.小鼠体重变化小鼠受照后，体重从第4天开始增加，照前注射组和照后注射组与生理盐水注射组相比,小鼠体重增加较多。
　　6.外周血细胞计数的变化照前注射组小鼠白细胞、淋巴细胞、血小板总数，在照后第7天分别为0.61×109/L、0.26×109/L、211.00×109/L，显著高于生理盐水注射组（P<0.05），在照后第14天分别为0.95×109/L、0.69×109/L、257.33×109/L，均显著高于生理盐水注射组（P<0.05）。照后注射组小鼠白细胞、淋巴细胞、血小板总数，在照后第14天分别为0.70×109/L、0.62×109/L、482.25×109/L，均显著高于生理盐水注射组（P<0.001）。照前注射组小鼠白细胞、血小板总数，在照后第7天显著高于照后注射组（P<0.01）。
　　7.外周血肝功能变化照前注射TAT-PprI蛋白的小鼠血液ALT、AST含量在照后第28天分别为45.41IU/L、133.92IU/L，显著低于照后注射组及生理盐水注射组（P<0.05）。
　　8.外周血肾功能变化照前注射TAT-PprI蛋白的小鼠血液UREA含量在照后第14及28天分别为6.00mmol/L、6.43mmol/L，显著比生理盐水注射组减少（P<0.05）。照后注射TAT-PprI蛋白的小鼠血液CREA含量在照后第7天为7.03mmol/L，比生理盐水注射组及照前注射组均较低（P<0.05）。照前蛋白注射组小鼠血液UREA含量在照后第28天明显低于照后注射组（P<0.01）。
　　9.脏器组织病理学观察无论照前注射 TAT-PprI蛋白还是照后注射TAT-PprI蛋白，均减轻了小鼠肝脏、肺脏、小肠、睾丸等组织的急性辐射损伤，并加快了各组织的恢复。
　　10.小动物成像观测 TAT-PprI蛋白注射后5min到24h，在小鼠各组织器官中可见荧光信号的分布。
　　11.骨髓细胞、脾淋巴细胞凋亡率变化照后第3~28天，与生理盐水注射组相比，无论照前注射TAT-PprI蛋白还是照后注射TAT-PprI蛋白均降低了小鼠骨髓细胞的凋亡率（P<0.01）。照前注射组及照后注射组脾淋巴细胞凋亡率在照后第7天比生理盐水注射组明显减少(P<0.001)。照前注射组骨髓细胞的凋亡率在照后第3、7天，比照后注射组更低(P<0.05)。
　　12.肝脏SOD、CAT活性及MDA含量变化与生理盐水注射组相比，照前注射组小鼠肝组织中SOD活力在照后第7天明显增加(P<0.05)，MDA的含量在所有时间点均明显减少(P<0.05)。照后注射组小鼠肝组织中CAT活力在照后第7、14天显著增加(P<0.01)，MDA的含量在第3、14天也显著减少(P<0.05)。照前注射组小鼠肝脏SOD活力在照后第3、28天显著高于照后注射组(P<0.05)。
　　结论：
　　1.成功获得了真核系统表达的耐辐射球菌PprI融合蛋白和TAT-PprI融合蛋白，经纯化定量获得了较大量蛋白质。
　　2.PprI蛋白和 TAT-PprI蛋白有效注射剂量范围分别为400-600μg/kg，600-800μg/kg；最佳注射剂量分别为600μg/kg、800μg/kg。
　　3.TAT-PprI蛋白可显著降低γ射线致死剂量照射小鼠死亡率，照前注射TAT-PprI蛋白效果更明显。
　　4.TAT-PprI蛋白可显著增加急性放射损伤小鼠的体重。
　　5.TAT-PprI蛋白可显著减轻急性放射损伤小鼠的外周血白细胞、淋巴细胞、血小板下降程度，照前注射TAT-PprI蛋白效果更好。
　　6.TAT-PprI蛋白对急性放射损伤小鼠的血液ALT、AST含量影响不大，照前注射TAT-PprI蛋白加快了ALT、AST含量的恢复，在一定程度上改善了肝功能。
　　7.照前注射TAT-PprI蛋白降低了急性放射损伤小鼠的血液UREA含量；照后注射TAT-PprI蛋白降低了急性放射损伤小鼠的血液CREA含量，对肾功能具有一定程度的影响。
　　8.TAT-PprI蛋白显著减轻了小鼠肝脏、肺脏、小肠、睾丸组织的急性放射病理学损伤，并加快了损伤的修复，照前注射TAT-PprI蛋白效果更明显。
　　9.TAT-PprI蛋白经静脉或肌肉注射可快速分布到小鼠各组织器官中。
　　10.TAT-PprI蛋白显著降低了急性放射损伤小鼠骨髓细胞和脾淋巴细胞的凋亡率，照前注射TAT-PprI蛋白抗细胞凋亡效果较好。
　　11.TAT-PprI蛋白增加了急性放射损伤小鼠肝脏组织中SOD酶、CAT酶的活性，降低了急性放射损伤小鼠肝脏组织中MDA的含量，但对SOD酶的活性影响不大，照前注射TAT-PprI蛋白抗氧化效果较好。
　　本文研究结果表明，真核系统表达的TAT-PprI原核蛋白对哺乳动物的急性放射损伤具有较好的防护和治疗作用，该作用与其抗氧化、抗凋亡的机制密切相关，TAT-PprI蛋白的防护作用比其治疗作用更显著，本研究结果为进一步临床应用提供了有价值的实验资料。