中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)凝血因子的cDNA克隆及表达模式研究

摘要

目的：凝血因子是一种在机体抗凝、促凝的凝血酶级联反应中有重要作用的生物活性蛋白，其功能主要是催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白和作为信号因子激发免疫系统，研究显示人凝血因子制剂是治疗血友病A的有效药物，鲎血淋巴制备的鲎试剂（Limulus amoebocyte lysate,LAL）对于极微量的病毒和污染物有较强敏感度，蛇凝血因子在炎症和治疗血栓病上有重要作用。河蟹（Eriocheir sinensis）为我国重要的经济蟹类，近年来由于养殖规模的扩大及水质的退化，病害造成的损失越发严重，为应对病害除了使用抗生素等药物外，对于河蟹自身免疫的研究也越来越受到重视。如何最大程度地激发其免疫潜能，获得抗病力强的个体，是水产动物遗传育种领域值得探究的主要课题。本研究通过克隆河蟹凝血因子基因cDNA序列，分析其基因结构，原核表达获得重组蛋白并制备多克隆抗体，运用Real-time RT-PCR、Western blot技术探究凝血因子在河蟹生理及病理条件下mRNA和蛋白的表达特征，揭示该基因在河蟹血凝及免疫过程中可能发挥的作用，以期为河蟹的抗病育种提供重要的理论基础。
　　方法：运用 RACE技术从河蟹肝脏中克隆凝血因子全长 cDNA，通过pET32a(+)原核表达系统表达凝血因子融合蛋白，并经镍柱纯化融合蛋白。通过Real-time RT-PCR技术分别检测：（1）健康河蟹各组织的凝血因子mRNA相对表达水平；（2）嗜水气单胞菌（A.hydrophila）感染河蟹后0 h，1.5 h，3 h，6 h，12 h，24 h和48 h在心脏、肝胰脏和血淋巴中凝血因子mRNA相对表达量的变化情况；（3）河蟹螯足折断后0.5 h，1 h，1.5 h，3 h和6 h在心脏、肝胰脏和血淋巴中凝血因子mRNA的相对表达量变化情况。并以镍柱纯化的河蟹凝血因子融合蛋白为抗原免疫家兔，制备河蟹凝血因子多克隆抗体，经琼脂双扩散法和间接酶联免疫吸附法检测抗体效价后，用Western bolt验证抗体的特异性，同时检测嗜水气单胞菌感染和断肢后河蟹心脏、肝胰脏和血淋巴中天然凝血因子蛋白的分泌特征。
　　结果：河蟹凝血因子cDNA全长2279bp，包含一个936bp的开放阅读框，编码长度为311个氨基酸的多肽，预测分子量为33.75kDa，理论等电点为9.38。同源性及系统进化树分析结果显示，河蟹凝血因子蛋白一级结构与大多数物种凝血酶原相似，并与内达华古白蚁（Zootermopsis nevadensis）凝血因子亲缘关系最近。对凝血因子在河蟹不同组织中mRNA相对表达水平的研究表明，凝血因子在心脏、肝胰脏和血淋巴中较其他组织表达量较高。嗜水气单胞菌感染后，河蟹肝胰脏和血淋巴中凝血因子mRNA相对表达量显著上调，并在3 h时达到高峰，心脏组织则在感染后24 h时达到高峰。人为折断河蟹螯足后，在心脏、肝胰脏和血淋巴中凝血因子mRNA相对表达量分别在0.5 h、1 h和1.5 h达到高峰。Western bolt结果显示，所制备的多克隆抗体可特异性识别河蟹凝血因子重组蛋白；对河蟹体内凝血因子蛋白的检测发现：未处理的健康河蟹心脏、肝胰脏和血淋巴组织内凝血因子蛋白含量极少，而经嗜水气单胞菌感染和断肢后，对应组织中则大量表达该凝血因子蛋白。
　　结论：我们克隆并鉴定了河蟹凝血因子，证明在无脊椎动物中也同样存在凝血因子。凝血因子基因主要在河蟹心脏、肝脏和血淋巴组织中大量表达。在嗜水气单胞菌感染和断肢后，河蟹心脏、肝胰脏和血淋巴组织中凝血因子mRNA相对表达量显著增加。Western blot结果显示，健康河蟹机体内凝血因子蛋白含量极低，在受到嗜水气单胞菌感染和断肢刺激后在河蟹心脏、肝脏和血淋巴组织中凝血因子蛋白大量表达。本研究从mRNA水平及蛋白水平研究了河蟹在机体受到感染和刺激后体内凝血因子的表达特征，推测凝血因子在河蟹防御病原菌和自切反应过程中扮演重要角色。

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文献综述

1河蟹的免疫防御系统

2凝血因子的研究进展及其生物学功能

3研究目的及意义

第一章 河蟹凝血因子cDNA的分子克隆和序列分析

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章 河蟹凝血因子原核表达与重组蛋白的纯化

1材料与方法

2结果

3.讨论

第三章河蟹在嗜水气单胞菌感染和断肢刺激下凝血因子mRNA的变化

1材料与方法

2结果

3讨论

第四章 河蟹凝血因子的多克隆抗体制备及在感染和断肢刺激下的蛋白表达特征

1材料与方法

2结果

3讨论

全文结论

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢