ING4通过逆转上皮间充质转化(EMT)抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭

摘要

目的：探讨慢病毒介导的生长抑制因子ING4过表达对乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用及其机制。
　　方法：
　　（1）以携带人源化ING4编码序列（CDS）的pAdTrack-CMV/ING4质粒为模板，利用ING4特异性引物（ING4-F：5'-gaa gct agc gcc acc atg gct gct ggg atg tat ttg-3'；ING4-R：5'-ata ggc gcg ccc tat ttc ttc ttc cgt tct tg-3'）
　　通过PCR扩增获得ING4 CDS片段。
　　（2）在GFP标记的pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒质粒的NheI和SgsI限制性酶切位点之间插入ING4目的片段构建ING4重组慢病毒质粒pLenti6.3/ING4/IRES/GFP，并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定。
　　（3）用脂质体Lipofectamine2000将构建正确的pLenti6.3/ING4/IRES/GFP及其对照pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒质粒分别与辅助包装质粒pLP1、pLP2、VSVG共转染293T人胚肾细胞包装GFP标记的ING4重组慢病毒（LV-ING4）及其对照空病毒（LV），并将慢病毒培养上清高速离心浓缩后，用有限稀释法根据GFP的表达进行滴度测定。
　　（4）LV-ING4、LV分别用10MOI的最佳感染剂量感染MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞，通过10μg/ml的灭瘟素（BSD）筛选后获得MDA-MB-468-LV-ING4（简写为MDA-MB-468-ING4）、MDA-MB-468-LV（简写为MDA-MB-468-Mock）。荧光显微镜、流式细胞仪检测GFP分析转基因效率，及RT-PCR、Western blot检测慢病毒介导ING4在MDA-MB-468细胞中的表达。
　　(5)采用Transwell迁移、侵袭实验检测MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力，分析慢病毒介导的ING4过表达对MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用。
　　(6)利用Western blot检测MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌细胞上皮间充质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2）的表达，分析慢病毒介导的ING4过表达抑制MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭的分子机制。
　　结果：
　　（1）成功制备了表达人源化ING4的GFP标记重组慢病毒（LV-ING4）。
　　（2）成功构建了慢病毒介导的ING4转基因MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞。
　　（3）慢病毒介导的ING4过表达能够明显抑制MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力，MDA-MB-468-ING4较MDA-MB-468-Mock的相对迁移、侵袭力分别为45.7％、36.8%。
　　（4）ING4能够明显下调MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞Snail1、Snail2 EMT诱导转录因子（EMT-TFs）和N-cadherin间充质标志物及上调E-cadherin上皮标志物，而对Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2 EMT-TFs几乎无影响。
　　结论：慢病毒介导的ING4过表达能够下调Snail1、Snail2 EMT-TFs逆转EMT的方式抑制乳腺癌转移。

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前言

第一部分 ING4重组慢病毒载体及ING4转基因乳腺癌细胞的构建

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1.重组慢病毒质粒的PCR、双酶切及DNA测序鉴定

2.慢病毒包装及滴度测定结果

3.慢病毒转基因效率检测

4.慢病毒介导的ING4表达鉴定

讨论

第二部分 ING4对乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用及其机制研究

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1. ING4抑制乳腺癌细胞的迁移能力

2. ING4抑制乳腺癌细胞的迁移能力

3. ING4通过逆转EMT抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭

讨论

参考文献

综述;ING4抑制乳腺癌的功能研究

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攻读硕士期间公开发表的论文

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