低氧预处理通过miR-206/Pim-1介导的抗凋亡途径抑制骨髓间充质干细胞凋亡

摘要

目的：目前大量研究证实，在干细胞或祖细胞中，Pim-1高表达可以加快细胞周期和增强其心脏再生能力；心肌梗死后，梗死区域Pim-1表达明显上升，并通过抑制细胞凋亡、促进细胞增值和分化、抑制心肌重构等途径发挥心脏保护作用。此外有研究发现，低氧可上调心脏干细胞中Pim-1表达从而抑制细胞凋亡。因此，我们提出以下假设：低氧预处理(hypoxia preconditioning,HP)是否可通过上调Pim-1表达从而抑制骨髓间充质干细胞移植前或移植后的凋亡？是否有microRNAs靶向调节Pim-1的表达？
　　方法：设置不同低氧处理时间（0h，6h，12h，24h）处理骨髓间充质干细胞，通过RT-qPCR及Western blot检测不同时间的低氧预处理后细胞中Pim-1基因的表达变化，将Pim-1表达最高的时间点作为最佳低氧处理时间，即低氧处理12h，并以此作为随后实验的低氧处理条件。通过数据库检索，我们预测到miR-206可以靶向调节Pim-1表达。通过实时定量 PCR检测低氧预处理后骨髓间充质干细胞中 miR-206的表达变化；并进行miR-206 siRNA细胞转染，观察miR-206的变化是否可以调控Pim-1的表达；进行双荧光素酶实验，进一步了解miR-206是否可在结构上与Pim-1相结合，并发挥调节作用。用流式细胞仪检测细胞凋亡、transwell实验、线粒体膜电位检测（JC-1法）实验分别被用来评估经不同处理低骨髓间充质干细胞（MSCs、HP-MSCs、HP-MSCsmiR-206、HP-MSCsanti-miR-206、HP-MSCsanti-miR-206+ Pim-1 inhibitor）的细胞凋亡、迁移及线粒体膜电位变化情况。挑选200-250g的雌性SD大鼠30只随机分为5组（MSCs组、HP-MSCs组、HP-MSCsmiR-206组、HP-MSCsanti-miR-206组、HP-MSCsanti-miR-206+ Pim-1 inhibitor组），建立心梗模型、行雄性大鼠来源的骨髓间充质干细胞的心肌内注射；4天后取心脏，PCR检测sry基因表达量评估各组细胞移植后心脏内的短期存活情况。
　　结果：q-PCR和western blot结果显示，低氧预处理后，骨髓间充质干细胞中Pim-1的表达呈时间依赖性，低氧处理12h时Pim-1表达量最高。qPCR检测发现，低氧预处理的骨髓间充质干细胞中的miR-206明显低表达；miR-206表达升高（转染miR-206 mimics）的骨髓间充质干细胞中，Pim-1基因水平明显降低，反义亦然。双荧光素酶报告基因表达分析显示，miR-206 mimics对Pim-1野生型载体的报告荧光有较明显的下调作用，相应结合位点突变后，突变型载体中的报告荧光有一定的恢复；进一步证实miR-206靶向调节Pim-1。此外，细胞功能实验发现，在低氧预处理的骨髓间充质干细胞中抑制miR-206的表达，能明显促进细胞的迁移、移植细胞的凋亡、保护线粒体膜电位；而抑制miR-206给细胞带来的益处可被Pim-1抑制剂所消除。在急性心肌梗死模型中，经低氧预处理的骨髓间充质干细胞移植后的凋亡率明显降低，而当此类细胞中的miR-206表达量升高时，移植后的细胞凋亡率明显提高。
　　结论：低氧预处理使骨髓间充质干细胞中Pim-1激酶表达上升；miR-206可通过靶向调控Pim-1的表达调节骨髓间充质干细胞的迁移和凋亡；miR-206/Pim-1抑制细胞凋亡的机制是维持线粒体膜电位的稳定；抑制低氧处理的骨髓间充质干细胞中miR-206的表达可以促进细胞在缺血心肌中的存活。

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摘要

材料和方法

1 实验材料

2实验方法

结果

1．骨髓间充质干细胞的分离与培养

2.低氧预处理促进骨髓间充质干细胞Pim-1表达

3.低氧通过抑制miR-206表达靶向调控Pim-1表达

4.低氧预处理通过抑制miR-206表达增强骨髓间充质干细胞的迁移能力

5.抑制miR-206表达可促进骨髓间充质干细胞存活

6.抑制miR-206表达保护骨髓间充质干细胞线粒体的完整性

7.miR-206 低表达可进一步促进经低氧预处理的骨髓间充质干细胞移植后的存活

讨论

一、干细胞及低氧预处理

二、Pim-1在低氧预处理骨髓间充质干细胞中的保护作用

三、miR-206靶向调节 Pim-1表达调节细胞功能

四、问题与展望

结论

参考文献

综述： microRNA在骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死方面的作用研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢