内生链霉菌(Streptomyces sp.)对黄花蒿生长和青蒿素合成的影响

摘要

青蒿素是药用植物黄花蒿（Artemisia annuaL.）中倍半萜内酯成分，是速效、低毒和安全的治疗脑型疟疾和抗氯喹疟疾的药物。目前，青蒿素主要是直接从黄花蒿植株中提取，但野生黄花蒿资源有限且分布零散品质、质量无法保障，从而限制了青蒿素的大规模生产。目前已有大量研究表明：植物内生菌能够产生新的生物活性物质，同时提高植物次生代谢的产量，是具有重要应用前景的生物资源。因此，本文研究了一株黄花蒿内生放线菌对黄花蒿生长、生理及青蒿素生物合成的影响，并对其影响青蒿素生物合成的机制作了初步探讨。
　　本文从野生的黄花蒿植株中分离获得了一株形态明显、生长较快的内生菌，通过形态观察及16S rDNA基因测序结果，进行同源性比对并构建了系统发育树，发现该菌株属于放线菌目链霉菌属，与天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、索马里链霉菌（Streptomyces somaliensis）、黄抗霉素链霉菌（Streptomyces flavofungini）相似性达到99％。该菌株16S rDNA基因序列在Genbank上注册获得登录号为KJ589646，定名为内生链霉菌（Streptomyces sp.）。我们发现该菌没有溶解无机磷的能力，但能够产生少量植物生长激素吲哚乙酸（IAA），且其产IAA的生物途径主要是L-色氨酸依赖型的。通过回接分离确认了内生链霉菌能够定殖在黄花蒿内部。内生链霉菌回接后对黄花蒿植株生长影响较小，能够轻微促进根的生长但对地上部分各生长指标均无影响。内生链霉菌回接后在植物生长后期，H2O2的含量达到对照的1.12倍，超氧化物歧化酶（SOD）的活性降低而H2O2的清除酶类（包括抗坏血酸过氧化物酶APX、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD）活性增加，提示内生链霉菌处理后，黄花蒿植株的防御反应增强。探究了在内生链霉菌回接66天后黄花蒿幼苗中青蒿素含量的变化及其机制。我们发现内生链霉菌处理后青蒿素含量相比对照提高了1.98倍（0.07 mg/g）。回接引起黄花蒿叶片腺毛数量变少但长度增大，同时，青蒿素生物合成途径中上游甲羟戊酸（MVA）途径关键酶基因表达提高，2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因表达提高但1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因表达降低，内生链霉菌对青蒿素生物合成下游的关键酶基因及腺毛相关转录因子表达并无明显影响，因此内生链霉菌处理后青蒿素含量的提高主要是因为链霉菌影响了青蒿素合成上游MVA途径产生了更多的异戊二烯，另外，腺毛的变化及MEP途径的变化可能也与青蒿素含量的提高有一定的关系。

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第一章 引言

1.1 黄花蒿及青蒿素研究现状

1.2 黄花蒿内生放线菌研究现状

1.3 本课题研究的主要内容

第二章 黄花蒿内生放线菌的分离、鉴定及生物活性分析

2.1 引言

2.2 实验仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 内生链霉菌对黄花蒿生长及生理的影响

3.1 引言

3.2 实验仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 实验结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 内生链霉菌对黄花蒿青蒿素合成的影响

4.1 引言

4.2 实验仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果与讨论

4.5 本章小结

论文总结与展望

一．主要结论

二．展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

附 录

致谢