外周血单个核细胞中风湿病相关基因的鉴定与评价

摘要

风湿病是一组以肌肉、关节疼痛为主要特征的疾病，大多数风湿病的发病机制目前尚未完全明了，不同种类的风湿病患者具有某些相同的症状，这一现象提示各种风湿病间可能存在相同的病理机制。已有研究表明遗传因素在风湿病的发病中发挥重要作用。目前，基因差异表达分析已广泛应用于各种类型的风湿病，鉴定出了大量的风湿病相关基因，并且发现不同种类的风湿病存在相同的遗传因素。然而，目前国内外针对风湿病共同遗传因素的研究较少，且多数研究纳入的风湿病种类少，因此还需要更多更系统的研究来探讨风湿病的共同遗传因素，从分子水平为风湿病的共同机制研究提供线索。
　　目的:
　　1.从人类外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclearcells,PBMCs）中鉴定不同风湿病的共同差异表达基因，并探讨其相互作用及生物学功能；
　　2.收集风湿病患者及未患有任何风湿病的对照样本，验证所鉴定的基因，并比较分析它们判别风湿病患者和非风湿病对照的能力；
　　3.对于经验证的基因，进一步鉴定相关的表观遗传调控因子。
　　方法:
　　1.从PubMed和基因表达数据库（Gene expression Ominibus，GEO）搜索获得风湿病相关基因表达数据集，搜索范围包括23种临床常见的风湿性疾病。
　　2.公共数据库来源的数据处理分析方法：采用 R软件的 MetaDE软件包进行各基因表达数据集的数据预处理和分析。基因差异表达分析采用 t检验，用Benjamini&Hochberg FDR法进行多重检验校正。采用STRING9.1进行蛋白质相互作用分析，用AmiGo2进行基因功能富集分析。
　　3.重复验证样本：本研究共纳入27例类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者及18例未诊断为任何风湿病的对照。RA患者来自苏州大学第一附属医院风湿免疫科门诊，对照来自苏州大学医学部。每位志愿者捐献10ml外周血用于芯片实验。
　　4.由培训合格的调查员收集RA患者及对照的一般人口统计学资料、生活方式、既往病史及现病史，以及 RA患者的C反应蛋白、关节肿胀和压痛数等疾病相关信息。由专业医务人员采集研究对象的外周血，由经过统一培训的实验人员用淋巴细胞分离液提取PBMCs进行芯片实验。mRNA、miRNA和DNA甲基化水平分别采用Agilent LncRNA& mRNA microarray、Affymetrix miRNA4.0和Illumina450K DNA甲基化芯片检测。
　　5.应用SPSS21进行统计分析，基因差异表达分析采用双侧t检验。用Medcalc软件绘制ROC曲线并比较分析各基因判别RA和对照的效能。采用TarBase数据库和 Targetscan软件获得调控基因表达的候选 miRNA，用 Pearson’s相关分析miRNA与mRNA表达水平的关联，以及mRNA与DNA甲基化水平的关联。用Cytoscape软件绘制基因、miRNA和DNA甲基化的调控网络。
　　结果:
　　1.从GEO数据库筛选获得6个风湿病相关基因表达数据集，包括4种常见的风湿病：类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎和强直性脊柱炎。另外，本研究还纳入了27例处于病情活动期的RA患者及18例非风湿病对照，均为女性。RA患者的平均年龄为47.33±10.91岁,非风湿病对照组的平均年龄为47.11±14.09岁。两组研究对象年龄差别无统计学意义（t=-0.06，P=0.953）。
　　2.通过基因差异表达分析鉴定出八个基因（TNFSF10、CX3CR1、LY96、TLR5、TXN、TIA1、PRKCH、PRF1），每个基因至少在所纳入的4种风湿病中的3种中有差异表达。
　　3.通过蛋白质相互作用分析发现所鉴定的八个基因存在广泛的文本关联，有三对基因存在共表达关系：CX3CR1/PF1、TLR5/TNFSF10和TNFSF10/PRKCH。在整个关系网络中，基因CX3CR1、PRF1、TLR5和TNFSF10作为网络的节点将八个基因联系在一起。
　　4.对所鉴定的八个基因的功能富集分析结果显示它们主要富集于免疫相关的生物学过程，包括细胞防御反应、机体对细菌和细菌相关物质的反应等。
　　5.在新的人群中的验证结果显示，TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1的表达量为RA病例组高于对照组（P<0.05）；LY96、PRKCH、CX3CR1和PRF1的表达量在两组间的差异无统计学意义（P>0.05）。
　　6.应用ROC曲线分析TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1区分RA和对照的效能，其 AUC分别为0.882（95％CI:0.750-0.959）、0.835（95%CI：0.695-0.929）、0.817（95%CI：0.673-0.916）、0.689（95%CI：0.534-0.819），四个基因联合应用时AUC为0.909（95%CI：0.786-0.974）。AUC最大的基因为 TNFSF10，它与TXN和TLR5的AUC差异无统计学意义（P>0.05）,与AUC最小的基因TIA1的差异有统计学意义（P<0.05）。四个基因联合应用时的ROC曲线下面积大于各个基因单独作用，但是只与基因TIA1的差异有统计学意义（P<0.05）。
　　7.对于TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1,本研究共鉴定出56对负相关的miRNA-靶基因,调控各基因的miRNA数量分别为7、2、17和31。其中，hsa-miR-4443和hsa-miR-142-5p均同时调控TIA1、TLR5和TNFSF10三个基因。Hsa-miR-3609调控TIA1、TXN和TLR5。Hsa-miR-342-3p和hsa-miR-3185均同时调控基因TIA1和TLR5。
　　8.TLR5的表达水平与其5’非翻译区的甲基化位点cg17938489的甲基化水平呈正相关。TNFSF10的表达水平与其 Body区的 cg01059398和 TSS1500区的cg22572614的甲基化水平呈负相关。
　　结论:
　　1.不同类型的风湿病之间存在共同的遗传因素，本研究针对类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和骨关节炎共鉴定出8个共同差异表达基因。八个基因主要富集于免疫相关的生物学过程。
　　2.所鉴定的8个基因中有4个在RA患者PBMCs中得到验证，它们均有一定的区分RA患者和非风湿病对照的能力。其中TNFSF10在病例和对照中差异表达较显著，且判别病例和对照的能力较强。
　　3．经验证的四个基因与相关的48个miRNA和3个甲基化位点可能在RA的发病中发挥作用。
　　4．对于本研究鉴定的8个风湿病共同差异表达基因，还需要在更大样本量、更多种类的风湿病患者中进行验证，针对所验证的基因进行深入研究，探讨风湿病的共同机制，可以为风湿病的预防、诊断以及治疗提供线索和依据。

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引言

材料与方法

1 公共数据库来源的风湿病相关基因表达谱

2 数据预处理及分析方法

3 蛋白质相互作用分析

4 基因功能富集分析

5 RA患者及非风湿病对照样本的收集

6 mRNA、miRNA和DNA甲基化芯片实验

7 在RA病例及非风湿病对照中验证所鉴定的基因

8 鉴定调控基因表达的miRNA

9 鉴定调控基因表达的DNA甲基化位点

结果

一、风湿病相关基因表达数据集

二、风湿病共同差异表达基因鉴定结果

三、蛋白质相互作用分析结果

四、功能富集分析结果

五、纳入研究的RA患者和非风湿病对照的一般情况及基因验证结果

六、比较分析基因判别RA患者和对照的能力

八、调控基因表达的miRNA

九、调控基因表达的DNA甲基化位点

讨论

参考文献

综述：四种常见风湿性疾病易感基因的研究进展

缩写词和中英文对照

攻读硕士学位期间公开发表的论文

附表1 RA患者一般情况和疾病活动度相关指标

附表2 TarBase来源的miRNA-靶基因相关分析结果

附表3 TargetScan预测结果及miRNA-mRNA相关分析结果

附表4 基因表达与DNA甲基化水平的相关分析结果

致谢