白细胞介素-21与慢性乙型肝炎患者恩替卡韦停药后复发的相关性研究

摘要

第一部分 IL-21对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者恩替卡韦停药后复发的预测价值
　　目的:初筛HBeAg阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者恩替卡韦（ETV）停药后病毒学复发的相关影响因素，研究停药时IL-21水平及Th1/Th2/Th17相关细胞因子对ETV停药后复发的预测价值。
　　方法：1.入选符合2012年亚太慢性乙型肝炎治疗共识停药标准的CHB患者112例，分析治疗过程中的临床资料，包括性别、年龄、基因型、ETV治疗时基线ALT水平、基线HBV DNA水平、基线HBsAg水平、病毒学应答时间（周）、HBeAg血清学转换时HBsAg水平、ETV停药时HBsAg水平与停药后病毒学复发的相关性。2.在停药时采用双抗体夹心ELISA方法检测血清IL-21水平，采用微量样本多重蛋白定量(CBA)法检测血清Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-α）、Th2（IL-4、IL-6、IL-10）、Th17（IL-17A）细胞因子水平，分析血清IL-21、Th1/Th2/Th17相关细胞因子与停药病毒学复发的相关性。Cox模型分析临床各因素与患者复发的相关性,ROC曲线用于确定相关因素及细胞因子对恩替卡韦停药后复发的预测价值。
　　结果：1.ETV停药后52周复发率为48.2％(54/112)，其中74%（40/54）患者的复发发生在停药后12～36周。2.复发组（VR）与持续病毒学应答组（SVR）年龄比较差异有显著统计学意义（P<0.001）。<30岁、30～39岁、40～49岁、≥50岁组患者停药52周病毒学复发率分别为25.0%（8/32）,36.7%(11/30),54.2%(13/24)和84.6%(22/26),≥50岁组患者复发率与其他3组结果比较差异有统计学意义(P<0.001,<0.001，=0.030)。3.以112例患者HBeAg血清学转换时HBsAg水平绘制ROC曲线下面积为0.751。取2.5log10IU/ml作为Cut-off值，HBeAg血清学转换时HBsAg水平<2.5、>2.5log10IU/ml患者复发率分别为9.5%(2/21)和57.1%(52/91),(P<0.001)。4.停药时SVR组血清IL-21水平明显高于VR组（P=0.041）。以112例患者停药时血清IL-21水平绘制ROC曲线，ROC曲线下面积为0.811。取50pg/ml作为Cut-off值，停药时IL-21水平≥50pg/ml和<50pg/ml患者病毒学复发率分别为25.4%(16/63)和74.6%(38/49)( P<0.001)。5.停药时SVR组患者IFN-γ水平高于VR组，IL-10水平低于VR组，且差异均有统计学意义（P=0.004，0.001）。停药时VR组与SVR组间Th17（IL-17A）水平比较结果差异无统计学意义（P>0.005）。6.多因素Cox模型分析，与停药后病毒学复发相关的影响因素依次为年龄（P=0.008）、HBeAg血清学转换时HBsAg水平（P=0.019）、停药时血清IL-21水平（P=0.034）、停药时血清HBsAg水平（P=0.045）。
　　结论：
　　1.年龄、HBeAg血清学转换时HBsAg水平、停药时血清IL-21水平、停药时HBsAg水平是停药后复发的相关影响因素。2.年龄大于50岁、HBeAg血清学转换时HBsAg水平≥2.5log10IU/ml或停药时HBsAg水平≥2.0log10IU/ml、停药时IL-21水平<50pg/ml的患者停药复发率高。
　　第二部分 IL-21在恩替卡韦停药后维持病毒学应答中的作用
　　目的：前瞻性研究HBeAg阳性CHB患者恩替卡韦停药后IL-21表达水平的变化特点，探讨IL-21在恩替卡韦停药后维持病毒学应答中的作用。
　　方法：横向人群纳入免疫耐受期患者(IT)、非活动性HBsAg携带者(IC)、ETV停药患者（ETV-W）各20例，以20例健康志愿者作为对照组(HC)，采用双抗体夹心ELISA方法检测血清IL-21水平，实时荧光定量PCR检测单核细胞（PBMC）IL-21mRNA，微量样本多重蛋白定量(CBA)法检测血清Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平，了解不同时期HBV感染者血清IL-21水平及Th1/Th2/Th17相关细胞因子的表达差异。纵向研究纳入78例ETV停药患者，根据停药52周复发情况分为病毒学持续应答组（SVR）和病毒学复发组（VR），在停药后各随访时间点检测血清IL-21水平、 Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平，分析各指标在SVR组和VR组的动态变化特点及其表达差异。
　　结果：1.横向研究结果显示IC组和ETV停药组患者IL-21水平显著高于IT组（均P<0.001）。纵向研究结果显示SVR组在ETV停药后52周观察中血清IL-2l水平稳定在较高水平，VR组患者呈相对下降趋势，在停药各随访时间点SVR组患者血清IL-21水平均高于VR组，且组间结果比较差异均有统计学意义（均P<0.001）。2.ETV停药患者总血清IL-2l水平与血清HBsAg滴度无显著相关性（r=-0.057，P=0.318）；但分组分析结果显示，SVR组血清IL-2l水平在随访过程中呈稳定高水平状态，而血清HBsAg水平保持在相对低水平，两者呈负相关（r=-0.241，P<0.001）。VR组血清IL-21水平与血清HBsAg滴度呈正相关(r=0.286，P<0.001)。3.横向研究结果显示ETV停药组（ETV-W）患者与IC组患者Th1型细胞因子IFN-γ水平均显著高于IT组和HC组（均P<0.001）。ETV停药组与IC组Th2型细胞因子IL-10水平显著低于IT组（均P<0.001）。4.纵向研究结果显示SVR组停药后Th1型细胞因子中IFN-γ水平稳定在较高水平，Th2类细胞因子IL-10水平呈显著下降趋势， SVR组患者在各随访时间点IFN-γ水平保持在较高水平，均显著高于VR组患者（P=0.004，均P<0.001）。VR组患者停药后Th1细胞因子IFN-γ水平前24周呈下降趋势，24周后呈上升趋势，但52周IFN-γ水平仍低于停药基线水平，Th2类细胞因子稳定在较高水平。VR组患者在停药各随访时间点IL-10水平均显著高于SVR组患者（P=0.001，均P<0.001）。
　　结论:1.停药后持续病毒学应答患者血清IL-2l呈高表达状态，与患者血清HBsAg水平呈正相关，提示IL-2l作为免疫调节因子在HBeAg阳性CHB患者恩替卡韦停药后维持病毒学应答中起到一定的作用。2.Th1细胞因子IFN-γ水平稳定在较高水平表达有利于恩替卡韦停药后维持病毒学应答，Th2细胞因子IL-10水平的高表达可能与病毒学复发有关。
　　第三部分 CXCR5+CD4+T细胞分泌IL-21在恩替卡韦停药后病毒学持续应答中的作用
　　目的：研究血清IL-21水平与CXCR5+CD4+T细胞的相关性，探讨CXCR5+CD4+T细胞分泌IL-21在维持恩替卡韦停药后病毒学应答中的作用。
　　方法：采用流式细胞术检测横向人群免疫耐受期(IT)、非活动性HBsAg携带者(IC)和恩替卡韦停药组(ETV-W)外周血CXCR5+CD4+T细胞的频数，了解不同时期HBV感染者外周血CXCR5+CD4+T细胞频数的表达差异；纵向分析ETV停药后CXCR5+CD4+T细胞频数变化的特点及其与血清IL-21水平的相关性；采用PMA/ionomycin刺激ETV停药患者PBMC，了解CXCR5+CD4+T细胞分泌细胞因子情况；应用HBV重叠多肽刺激PBMC，分析HBV特异性IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数在SVR组和VR组的表达差异。
　　结果：1.ETV停药组患者 CXCR5+CD4+T细胞的频数显著高于免疫耐受期（IT）和健康志愿者(HC)（P<0.05）；2.VR组70.3%（26/37）的患者外周血CXCR5+CD4+T细胞频数在停药后出现下降，而SVR组患者出现下降的比例只有41.5%（17/41）,两组间变化模式有统计学差异（P=0.013）。SVR组外周血CXCR5+CD4+T细胞的频数在ETV停药第0、12、24和52周时间点均显著高于VR组患者(均P<0.05)。3.患者停药后外周血CXCR5+CD4+T细胞频数变化与IL-21水平变化趋势相一致，且呈正相关（r=0.626， P<0.001)。4.采用PMA/ionomycin刺激PBMC，ETV停药组患者CXCR5+CD4+T细胞分泌IL-21的水平显著高于IFN-γ、IL-4以及IL-17(均P<0.001)。5.采用HBV重叠多肽刺激PBMC，结果显示ETV停药组患者HBV特异性IL-21+CXCR5+CD4+T细胞的频数高于IT组和HC组(均P<0.001)。各随访时间点HBV特异性的IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数在SVR组表达较VR组高，且停药12周、24周、52周组间结果比较均有统计学意义(P<0.05， P<0.001，P<0.001)
　　结论：恩替卡韦停药后外周血CXCR5+CD4+T细胞频数变化与IL-21水平变化趋势相一致，且呈正相关，持续病毒学应答组HBV特异性IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数显著高于复发组，提示CXCR5+CD4+T细胞通过分泌IL-21在维持恩替卡韦停药后病毒学应答中发挥一定的作用。

目录

声明

引言

参考文献

第一部分 IL-21对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者恩替卡韦停药后复发的预测价值

前言

一、材 料

二、方 法

三、结 果

四、讨 论

参考文献

第二部分 IL-21在恩替卡韦停药后维持病毒学应答中的作用

前言

一、材 料

二、方 法

结果

讨论

参考文献

第三部分 CXCR5+CD4+T细胞分泌IL-21在恩替卡韦停药后病毒学持续应答中的作用

前言

一、材 料

二、方 法

结果

讨论

参考文献

全文总结

本研究的主要结果：

存在的问题与展望

综述:核苷（酸）类似物停药复发的相关影响因素研究进展

攻读学位期间公开发表的论文

致谢