下丘脑弓状核miR-137-3p在炎性疼痛中的作用及机制研究

摘要

目的：通过研究完全弗氏佐剂（Complete Freund's Adjuvant，CFA）模型大鼠中下丘脑弓状核（hypothalamic arcuate nucleus，ARC）内的miR-137-3p、miR-195-5p与Src酪氨酸蛋白激酶和NMDA受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）的亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的表达及其相互关系，从而探讨miR-137-3p，miR-195-5p如何通过调节Src和NMDAR参与炎性痛，在基因水平寻找治疗炎性痛的新靶点。
　　方法：
　　（1）运用生物信息学工具筛选出能与Src及NMDAR亚基GluN1、GluN2A、GluN2B3’非翻译区（3' untranslated region,3'UTR）结合的miRNA，从中选取匹配度最佳的miR-137-3p、miR-195-5p进行研究。
　　（2）选用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，在大鼠右足皮下注射CFA100μL，制备炎性疼痛模型（CFA组），相同部位注射等量生理盐水作对照组（NS组）。采用von Frey（VFF）法和热辐射-缩腿法分别测定第0天、1天、3天、5天、7天、14天六个时间点大鼠的机械痛阈（Mechanical withdrawal threshold，MWT）和热痛阈（Thermal withdrawal latency，TWL）。
　　（3）用蛋白质印迹法（Western Blot）检测不同时间点ARC区域Src、GluN1、GluN2A及GluN2B蛋白的表达量。同时运用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法检测不同时间点ARC中miR-137-3p、miR-195-5p与Src、GluN1、GluN2A及GluN2B mRNA的表达水平。表达水平的相关性通过线性回归的方法进行统计学分析。
　　（4）运用原位杂交结合免疫组织化学的方法检测注射CFA3天后（痛阈最低时）大鼠ARC区域内miR-137-3p和Src、GluN2A的表达情况。
　　（5）采用脂质体转染的方法，将miR-137-3p的模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）以400nM、600nM的浓度转染下丘脑弓状核原代神经细胞。24、48小时后收集细胞提取RNA，使用Real-time PCR的方法检测miR-137-3p、Src及GluN2A mRNA的表达情况。同时收集细胞提取蛋白，使用Western Blot的方法检测Src、GluN2A蛋白的表达情况。
　　（6）构建含有miR-137-3p靶位点序列（野生型pGL3-control-Src-137-WT、pGL3-control-GluN2A-137-WT）和不含靶位点序列的重组质粒（突变型pGL3-control-Src-137-MT、pGL3-control-GluN2A-137-MT），分别与100nM的miR-137-3p mimic共转染HEK293T细胞系，通过双荧光素酶报告基因检测，验证Src、GluN2A与miR-137-3p的靶向关系。
　　（7）选取CFA造模3天的大鼠ARC内微量注射miR-137-3p类似物(agomir)及选取正常大鼠注射抑制物(antagomir)，检测改变ARC中miR-137-3p的表达对大鼠痛行为学的影响以及对Src、GluN2A mRNA和蛋白水平的影响。
　　结果：
　　（1）利用生物信息学软件预测与Src及GluN2A密切相关的miRNA为miR-137-3p，与GluN1及GluN2B密切相关的miRNA为miR-195-5p。
　　（2）行为学结果显示，与对照组相比，注射CFA后大鼠右足机械痛阈和热痛阈在1天后明显降低（P<0.001），在第3天时降至最低（P<0.001），并持续至注射后第14天（P<0.001）。
　　（3）Western Blot和Real-time PCR的结果显示：和对照组相比，在蛋白水平，CFA大鼠ARC内Src的表达在第1、3、5、7、14天（P<0.05），GluN1在第3、5、7天（P<0.05），GluN2A在第3、5天（P<0.05），GluN2B在第3、5、7、14天均明显上升（P<0.05）；在mRNA水平，CFA大鼠ARC内miR-137-3p在第3天、5天、7天时低于对照组（P<0.01），3天后降至最低（P<0.05），而Src mRNA水平在第3天、5天、7天，GluN2A在3天、5天时间点均高于对照组（P<0.05）。统计学分析显示miR-137-3p与Src表达水平呈负性相关的关系（R2=0.2562，P<0.01），与GluN2A也呈现出负性相关的关系（R2=0.2687， P<0.01）。另外，miR-195-5p在第1、5、7天明显低于对照组（P<0.05）。GluN1 mRNA表达在第5、7天有显著差异（P<0.05），GluN2B的表达在第5、14天明显高于对照组（P<0.05）。统计学分析显示miR-195-5p和GluN1（R2=0.0641，P>0.05），GluN2B（R2=0.0623，P>0.05）均不相关。
　　（4）原位杂交联合免疫组织化学结果显示，miR-137-3p和Src、GluN2A在大鼠ARC内均有表达。
　　（5）原代弓状核细胞转染不同浓度的miR-137-3p mimic后，细胞内miR-137-3p水平在24h和48h均升高，相对应的Src和GluN2A的表达在不同的时程分别降低。反之转染不同浓度的inhibitor后细胞内miR-137-3p明显降低，相对应的Src和GluN2A的表达则在不同的时程分别升高，较NC（Negative control）组有统计学差异。Western blot检测Src和GluN2A蛋白与mRNA水平一致。
　　（6）双荧光素酶报告基因检测结果显示，转染野生型pGL3-control-Src-137-WT或pGL3-control-GluN2A-137-WT时，miR-137-3p mimic诱导的荧光素酶活性显著降低，分别超过40％和35%，这种减少存在序列特异性，因为含有预测结合位点突变体的pGL3-control-Src-137-MT或pGL3-control-GluN2A-137-MT的相对荧光素酶活性并未显著下降。
　　（7）在CFA大鼠ARC内微量注射miR-137-3p agomir可提高大鼠机械痛和热痛痛阈值（P<0.001），并减少ARC中Src及GluN2A的蛋白表达量（P<0.05）。而注射miR-137-3p antagomir虽有降低正常大鼠痛阈的趋势，但与对照组相比，差异无统计学意义。
　　结论：
　　（1）在CFA诱导的大鼠炎性疼痛模型中，ARC内miR-137-3p的表达降低，具有明显的时间依赖性。ARC中miR-137-3p的表达与Src、GluN2A均呈现显著负相关。miR-195-5p的表达虽也呈现一定的时序性，但其与预测的靶基因GluN1、GluN2B表达不相关。
　　（2）在体外离体细胞模型上也得到了miR-137-3p与Src、GluN2A均存在负性调节的关系，Src和GluN2A可能是miR-137-3p的新靶基因。
　　（3）CFA注射后3天大鼠痛阈最低，在大鼠ARC内微量注射miR-137-3p agomir可提高炎症大鼠的痛阈，并下调ARC中Src及GluN2A蛋白的表达量。提示miR-137-3p可能通过调节Src及GluN2A的表达参与CFA炎性疼痛的调节，可作为镇痛的新靶点进行深入研究。

目录

声明

引言

第一部分 炎性疼痛大鼠下丘脑弓状核内miR-137-3p、miR-195-5p与Src、NMDAR的探索性研究

材料与方法

实验结果

第二部分 miR-137-3p与Src及GluN2A基因靶向关系验证

材料与方法

实验结果

第三部分 下丘脑弓状核内miR-137-3p在炎性疼痛中的机制研究

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文创新点

问题与展望

参考文献

综 述：miRNA在慢性疼痛中的研究进展

附录

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢