肿瘤细胞器多级靶向联合载药脂质体的构建及其抗肿瘤研究

摘要

目的：本文通过构建一个多级靶向联载脂质体抗肿瘤递送系统，即在脂质体表面修饰聚乙二醇以及肿瘤靶向肽RGD和穿透肽TAT，并分别在脂质体空腔和脂质膜中包载细胞核靶点的抗肿瘤药物盐酸阿霉素（DOX·HCl）和具线粒体靶向的药物三苯基膦-白藜芦醇（TR），使该脂质体具备向肿瘤组织、肿瘤细胞和肿瘤细胞器逐级靶向递药的功能，将联合携载药物递送至靶细胞器并发挥协同促凋亡作用，从而增强抗肿瘤活性。同时，对其理化性质和体内外抗肿瘤活性进行了考察。
　　方法：本文采用1H NMR对合成的脂质材料DSPE-PEG2000-RGD和DSPE-PEG2000-TAT进行结构表征。采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备多功能脂质体 T/R-LP-(DOX+TR)，并对其粒径、电位、包封率和体外释放进行表征。以乳腺癌细胞株 MDA-MB-231细胞为模型，通过 MTT法考察不同脂质体对MDA-MB-231细胞的细胞毒性并考察其联合作用。采用流式细胞术考察无靶、单靶和双靶脂质体的摄取差异。采用共聚焦显微镜观察脂质体进入细胞后的转运情况。另外，本文还通过线粒体功能考察递药系统的抗肿瘤作用机制，包括采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，采用JC-1染色法考察线粒体膜电位， caspase分光光度法检测凋亡蛋白酶活性等实验。最后，本文构建MDA-MB-231荷瘤裸鼠移植模型，通过小动物活体成像和体内抑瘤实验考察多功能脂质体的体内分布及其体内抗肿瘤活性，并采用HE染色法观察给药后肿瘤和主要器官的病理变化。
　　结果：1H NMR表征DSPE-PEG2000-RGD和DSPE-PEG2000-TAT成功合成。制备的多功能脂质体粒径在100~150 nm之间，电位在-20~-10 mV范围内，且PDI<0.3。对 DOX:TR投药比进行筛选，优化二者投药比小于2:1。体外释放实验表明联载脂质体中两种药物的释放较单载药脂质体释放快，且72 h后累积释放率显著增加。MTT试验表明多功能脂质体T/R-LP-(DOX+TR)对MDA-MB-231细胞的细胞毒性有显著增强，且DOX和TR存在协同作用。流式细胞实验结果表明双靶脂质体的摄取是RGD单靶脂质体的1.19倍，是TAT单靶脂质体的1.24倍，表明双靶脂质体协同促进细胞摄取。通过共定位实验发现脂质体携载药物进入细胞后能够分别释放DOX和TR至作用靶点细胞核和线粒体。线粒体功能实验证实 T/R-LP-TR抗肿瘤作用机制是通过激活线粒体凋亡通路，促使线粒体膜电位丧失，最终激活凋亡蛋白酶的级联反应促使肿瘤细胞凋亡。小动物活体成像实验表明双靶脂质体在体内能够靶向于肿瘤组织并减少药物在正常组织的蓄积，且靶向作用优于单靶脂质体。体内抑瘤实验则进一步说明多功能脂质体T/R-LP-(DOX+TR)在体内能有效抑制肿瘤生长，发挥较好的抗肿瘤效果。HE染色实验显示 T/R-LP-(DOX+TR)不仅使肿瘤组织发生大面积坏死，还可以有效降低DOX的毒副作用。
　　结论：本文成功制备了多功能脂质体 T/R-LP-(DOX+TR)。制备的脂质体粒径均一，分散良好，对两种药物均有较高的包封率，体外释放可见两种药物的释放具有协同作用。体内外抗肿瘤活性实验结果显示，多功能脂质体可将共携载药物通过逐级靶向于肿瘤组织、肿瘤细胞和肿瘤细胞内作用位点，协同促进肿瘤细胞凋亡，从而增强治疗效果，缓解DOX的毒副作用，该递药系统为肿瘤治疗方向提供了新的思路。

目录

声明

前言

1. 肿瘤靶向策略

2. 主动靶向脂质体的研究进展

3. 亚细胞器与细胞凋亡

4. 模型药物简介

5. 课题设计思路及研究内容

第一章 线粒体靶向药物和脂质材料的合成及表征

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与小结

第二章 多功能脂质体的构建和表征

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与小结

第三章 多功能脂质体的体外抗肿瘤活性研究

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论与小结

第四章 线粒体靶向脂质体的抗肿瘤机制考察

1 材料与仪器

2 实验内容

3 实验结果

4 讨论与小结

第五章 多功能脂质体的体内抗肿瘤活性研究

1 材料与仪器

2 实验方法

3实验结果

4 讨论与小结

全文总结

后续工作与展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢