三类罕见出血性疾病的临床与基础研究

摘要

一、20例伴有血液学异常的植物固醇血症研究
　　植物固醇血症(Phytosterolemia)被认为是一种罕见的常染色体隐性遗传性脂质代谢疾病。患者最明显特征是血浆中谷固醇、菜固醇和豆固醇等植物固醇明显升高，临床主要表现为黄色瘤、早发性冠心病、关节炎、肝损害及血液学异常。而巨大血小板病(giant platelet disorders, GPD)是一组异质性疾病，表现为血小板体积增大，数目减少或正常，并伴有不同程度的出血。近年来随着检测手段尤其是基因测序技术的普及，发现一类以巨大血小板为特征的疾病是植物固醇血症的特殊表现形式。本研究通过对20例来自13个不同家系表现为巨大血小板、红细胞异常及脾肿大切除的患者进行检测分析，发现该类患者血浆中植物固醇含量明显升高、ABCG5或ABCG8基因存在纯合或双重杂合突变，最终确诊为植物固醇血症。对这种伴有典型血液学改变的植物固醇血症患者进行临床特征研究，有助于我们正确认识、诊断和治疗该类疾病。
　　目的：对20例伴有血液学异常的植物固醇血症家系进行表型诊断及基因分析并总结患者的临床特征。
　　方法：收集患者病史并常规体检进行外周血分析、血脂分析，红细胞渗透脆性实验，光学显微镜观察红细胞及血小板的形态；流式细胞仪(FCM)检测血小板膜糖蛋白(GP)Ib/IX和 IIb/IIIa；比浊法分析血小板聚集；高效液相色谱法(HPLC)检测血清中豆固醇、二氢胆固醇和谷固醇含量；PCR扩增结合测序分析先证者和家系成员ABCG5和ABCG8基因外显子和侧翼序列突变情况，并通过SNP数据库排除多态性。
　　结果：20例植物固醇患者中女性占60％（12例），男性占40%（8例），患者确诊的中位年龄47岁（最小23岁，最大67岁）。85%的患者以血小板减少就诊，所有患者均有脾肿大切除史，切脾的平均年龄在26.72岁。90%的患者就诊时眼睑出现黄褐瘤，45%患者出现肝功能异常，2例患者曾出现严重黄疸，25%患者出现心血管疾病，20%的患者伴有关节炎。而血涂片分析发现所有患者血小板体积偏大，数目正常或减少，红细胞形态异常，尤以口形红细胞增多。外周血溶血检查发现所有患者红细胞脆性增加，开始溶血氯化钠浓度平均为0.572%（正常0.44-0.48%）患者血浆谷固醇平均值455.54±227.00 mg/L，豆固醇298.50±122.67 mg/L，分别高于正常人15倍及30倍。测序分析共发现了14种基因突变，其中2/3位于ABCG5基因上，1/3位于ABCG8基因上，而p.(R446Ter)突变有重现性，分别见于2、4和12三个不同的家系中。
　　结论:
　　1.对伴有巨大血小板、红细胞形态异常合并渗透脆性增加及脾肿大的患者要出现要考虑植物固醇血症诊断。
　　2.植物固醇血症发病率实际上不是很低，而伴有巨大血小板、溶血性贫血及脾肿大的患者是植物固醇血症的特殊亚型。
　　二、1例NBEAL2基因突变导致的灰色血小板综合症家系的临床与基础研究
　　灰色血小板综合征（Gray platelet syndrome, GPS）是由于血小板及巨核细胞内α颗粒及其内容物缺乏而导致血小板功能不全的临床综合症，患者通常表现为轻度的出血、脾大及由于网硬蛋白的沉积而出现的进展性骨髓纤维化。血涂片检查Wright染色发现血小板呈灰蓝色而命名。GPS是一类复杂的疾病，由多种原因引起，遗传形状也不尽相同。其中NBEAL2基因突变是引起常染色体隐性遗传的灰色血小板综合征的主要病因，但尚有部分患者未能明确病因。本研究通过对1例表现为灰色血小板的家系进行研究，以明确诊断并分析临床特征。
　　目的：总结1例灰色血小板综合征家系的临床和实验室特征。
　　方法：通过对1例灰色血小板综合征的家系进行临床分析，血细胞计数仪计数外周血细胞，血涂片瑞士染色观察细胞形态，应用比浊法检测血小板聚集及释放功能、流式细胞仪分析血小板膜糖蛋白含量经凝血酶刺激后膜表面P选择素表达、电镜分析患者血小板的超微结构。全外显子测序及PCR扩增NBEAL2基因全外显子并测序检测基因突变。
　　结果：先证者主要表现为皮肤黏膜出血、月经量多及多次黄体破裂等严重出血，外周血小板计数减少；光镜可见先证者血小板偏大，直径3-5um，血小板呈均匀灰蓝色，内部无明显颗粒；透射电镜可见血小板缺乏α-颗粒；患者ADP、胶原、U46619与瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能降低，而胶原及U46619诱导的血小板释放实验正常。患者P选择素表达在血小板静息状态及活化状态与正常人血小板无明显差别。
　　先证者NBEAL2基因存在32号外显子g.C27713A纯合突变，导致蛋白p.E1726提前终止，其父母(III-6及III-7)为该突变的杂合子。家系中p.E1726ter突变的携带者无明显出血，血小板数量及功能正常，血涂片可见血小板大小不一，大血小板多见。
　　此外，通过对文献报道的19个家系27例患者总结，发现表现为终止突变或移码突变的患者出血都较重，与该例患者存在p.E1726ter突变表现一致。
　　结论：
　　1该例灰色血小板综合征家系呈现为常染色体隐性遗传，由NBEAL2(g. NG＿031914.1) g.27713C>A.纯合突变导致p.Glu1726*提前终止。
　　2 NBEAL2基因(g. NG＿031914.1) g.27713C>A突变携带者血小板生成受到轻度影响。
　　三、2例α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变研究
　　正常凝血过程受到凝血-抗凝-纤溶系统的精细调节而保持动态平衡。系统中多数酶原都属丝氨酸蛋白酶，血液中同时存在相应的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），后者为一类结构上同源的超家族，其活性中心能结合并灭活相应的丝氨酸蛋白酶。抗凝血酶（antithrombin，AT）与α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1AT或A1AT）同属于serpins蛋白家族，具有相似的结构，但作用底物及功能不同。AT的主要作用是灭活凝血酶，α1-抗胰蛋白酶是主要功能是对抗由多形核白细胞吞噬作用时释放的溶酶体蛋白水解酶，当α1-AT活性中心358位上的甲硫氨酸(Met)被精氨酸(Arg)所取代后与AT活性中心相同，α1-AT原本的抗蛋白酶活性丧失，而表现为强烈的抗凝血酶活性,结果使患者表现为出血倾向，此称为α1-抗胰蛋白酶Pittsburg突变（A1AT Pittsburg突变）。
　　目的：分析2例α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变患者的临床和实验室特点，并复习文献。
　　方法：采用凝固法或发色底物法分别检测凝血时间及凝血因子活性；比浊法测定血小板聚集功能( PAgT)；采用毛细管电泳法测定血清蛋白；PCR扩增目的DNA片段并测序检测突变。
　　结果：先证者多次术后出血及黄体破裂，女儿未成年尚无出血表现。两例患者的APTT、TT均明显延长，与正常人血浆混和1:1不能纠正;凝血因子Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性明显降低；蛋白C/蛋白S活性水平均为0%；对终浓度为1u/ml凝血酶的血小板聚集降低，但升至4 u/m l时PAgT恢复至48%；血清α1球蛋白电泳条带异常；DNA测序结果显示两例患者的α1基因均存在T10038G突变，导致358位Met突变为Arg。
　　结论：
　　1.α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变患者表现出明显的凝血异常，且出血表现有较大的差异，黄体破裂出血可能是女性患者的一个明显特征。
　　2.α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变患者典型的血清电泳表现为血清白蛋白后有拖尾条带，α1条带较弱且模糊分散，扫描峰图可见α1峰平缓。

目录

声明

引言

第一部分 20例伴有血液学异常的植物固醇血症研究

第二部分 1例NBEAL2基因突变导致的灰色血小板综合症家系的临床与基础研究

第三部分 2例α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变研究

参考文献

一、20例伴有血液学异常的植物固醇血症研究

对象和方法

结果

讨论

参考文献

二、1例NBEAL2基因突变导致的灰色血小板综合症家系的临床与基础研究

病例和方法

结果

讨论

参考文献：

三、2例α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变研究

病例和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述:先天性血小板减少症的发病机制研究进展

攻读学位期间发表的文章

致谢