炎症性肌病新型动物模型的建立及OX40/OX40L共刺激分子在多发性肌炎发病中的作用及机制研究

摘要

第一部分：肌球蛋白结合蛋白C原核表达载体的构建及表达
　　目的：构建人快速型肌球蛋白结合蛋白 C(MYBPC2)融合蛋白表达载体，高效表达和纯化pET28a—MyBPC2融合蛋白，为进一步研究炎症性肌病动物模型的建立提供基础。
　　方法:以Human MYBPC2 cDNA为模板，用F、R引物做PCR扩增获得目的基因。目的基因用NcoI/XhoI克隆至pET28a(+)表达载体中。使用 IPTG诱导表达目的蛋白pET28a- MYBPC2。
　　结果：经层析纯化、透析复性，SDS—PAGE分析鉴定。优化表达条件，将诱导条件调整至26度，经分析目标蛋白在上清与包涵体中都有表达，因此通过 Ni柱亲和纯化上清获得目的蛋白。
　　结论：本方法可以高效制备人MYBPC2蛋白片段，为研究建立新型实验性炎症性肌病的动物模型提供了良好的基础与方法。
　　第二部分新型免疫性肌炎动物模型的建立研究
　　目的：采用重组人快型肌球蛋白结合蛋白 C（MYBPC2）免疫小鼠获得自身免疫性肌炎模型。探究低剂量蛋白免疫小鼠的条件及方法。
　　方法：将 MYBPC2与完全弗氏佐剂充分乳化后，在C57BL/6小鼠背部皮下及足掌多点注射免疫，同时腹腔注射百日咳毒素。分为高低剂量融合蛋白来分别免疫小鼠，在免疫前及面以后7d,14d,21d,28d检测其肌力，并且在第7、14、21、28日通过HE染色及免疫组化染色观察肌肉组织主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子以及炎症细胞浸润等病理变化。采用秩和检验进行统计分析。
　　结果：①与现存有报道的研究中的高剂量融合蛋白（600ug/只）相比，低剂量融合蛋白免疫小鼠也可获得较为满意的炎症性肌病动物模型，其中小鼠肌肉损害在14天最显著，模型组小鼠肌组织可见肌纤维变性、坏死，肌纤维萎缩和炎细胞浸润。②小鼠模型组肌肉耐力54.49s与对照组135.40（U=8.00,P＜0.05具有统计学差异）相比明显下降。模型组肌纤维表面 MHC-Ⅰ类分子阳性，肌纤维间及血管周围区域可见散在CD4+及CD8+ T细胞。
　　结论：使用低剂量融合蛋白成功诱导炎症性肌病动物模型且动物模型死亡率低，动物模型与人体炎症性肌病具有相似的临床和肌肉病理特征，为进一步研究肌炎发病机制及相关治疗提供了新型且经济安全的工具。
　　第三部分OX40/OX40L共刺激分子在炎症性肌病中的发病机制研究
　　目的：研究多发性肌炎患者肌肉组织及外周血中OX40/OX40L的表达情况及小鼠模型炎症反应。
　　方法：本研究利用免疫组化技术分析CD8、CD20、OX40、OX40L在患者肌肉组织中的表达情况，流式细胞检测技术研究患者外周血中OX40/OX40L的表达情况，以及利用ELISA法测模型小鼠血清细胞因子的表达以观察炎症反应及OX40/OX40L的上调。
　　结果：（1）免疫组织化学结果显示CD8、CD20、OX40、OX40L等主要定位于肌肉组织的肌肉细胞的细胞浆，其阳性着色产物表现为棕黄色颗粒。结果显示在7例多发性肌炎患者中，全部患者CD8均有阳性表达，其中OX40阳性表达为5例，占71.4％， OX40L阳性表达为6例，占85.7%。（2）OX40：健康者中的CD4+T细胞上为56.9±0.50%、多发性肌炎为87.9±0.75%，健康者中的CD8+T细胞上为64.5±0.95%，多发性肌炎为75.8±0.73%OX40L，经统计学分析，差异（P<0.05）具有统计学意义。OX40L：健康者中 CD19+T细胞上为40.7±0.85%、多发性肌炎的为95.9±0.79%，健康者中CD14+T细胞上为15.3±0.56%、多发性肌炎的为35.6±0.33%，经统计学分析差异（P<0.05）均存在统计学意义。
　　结论：多发性肌炎患者外周血中 OX40/OX40L共刺激分子的表达；多肌炎患者肌肉组织中炎症细胞中出现 OX40、OX40L；免疫后小鼠血清细胞因子较前均上调。初步验证了 OX40/OX40L共刺激分子参与了多发性肌炎的发病，并对肌纤维细胞的毒性破坏过程中起着重要的作用。

目录

声明

研究背景

参考文献

第一部分：肌球蛋白结合蛋白C原核表达载体的构建及表达

1.材料与方法

2.融合蛋白的表达

结果：

3.讨论

参考文献

第二部分：新型免疫性肌炎动物模型的建立研究

1.材料与方法

2.统计学处理

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第三部分：OX40/OX40L共刺激分子在炎症性肌病中的发病机制研究

1.临床资料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

结论

综述:特发性炎症性肌病的诊断进展

一、发病机制

二、临床特征

三、实验室检查

四、影像学检查

五、病理学表现

六、诊断标准：

结论：

参考文献

缩写词表

攻读学位期间发表的文章

本课题获得的基金资助

致谢