不同频率的周期性机械拉伸对兔纤维环源干细胞增值的影响

摘要

目的：
　　提取鉴定兔纤维环源干细胞（Annulus Fibrosus-derived Stem Cells, AFSCs），探讨不同频率的周期性机械拉伸对兔纤维环源干细胞增殖的影响。
　　方法：
　　这项研究的目的是以离体实验探讨不同频率的周期性机械拉伸对兔纤维环源干细胞的影响。分离6周龄左右新西兰大耳白兔的纤维环，酶消化法提取、培养并鉴定纤维环源干细胞，将细胞种植于纤连蛋白修饰的聚二甲硅氧烷拉伸皿内，按照以下不同频率的周期性机械拉伸条件来分组实验，实验组细胞周期性机械拉伸频率为0.1Hz、0.5Hz、1.0Hz、2.0Hz，拉伸幅度为5％，加载相同的拉伸时间4h。对照组纤维环源干细胞与实验组细胞保持培养条件一致的前提下不进行拉伸刺激。应用RT-PCR及 Elisa检测加载不用频率的周期性循环拉伸应变后细胞合成与分解代谢基因（COL-1，COL-II,Aggrecan,MMP-3,MMP-13,Timp-1）及相关蛋白的表达变化；应用免疫荧光染色评估兔纤维环源干细胞在采用不同频率的周期性机械拉伸后形态学上的变化。
　　结果：
　　成功提取并鉴定出兔纤维环源干细胞，具有良好的增值能力及干细胞表面标记物OCT-4,Nucelostemin(NS)及SSEA-4表达；具有成骨、成脂及成软骨的多向诱导分化能力。加载以不同频率周期性机械拉伸的兔纤维环源细胞在0.5Hz频率时合成代谢基因(aggrecan, type I collagen, and type II collagen)及相关蛋白明显表达，分解代谢基因（MMP-3,MMP-13，TIMP-1）及相关蛋白表达受限。在应用1.0Hz、2.0Hz高频率的周期性循环拉伸力学过度刺激时，兔纤维环源干细胞的分解代谢基因（MMP-3,MMP-13，TIMP-1）及相关蛋白则呈现高表达，尤其是2.0Hz频率拉伸时，合成代谢基因（aggrecan, type I collagen, and type II collagen）及相关蛋白则受到了明显的抑制。在应用了0.1Hz、0.5Hz、1.0Hz、2.0Hz频率的周期性机械拉伸刺激后细胞形态学上未见明显变化，在2.0Hz拉伸刺激的细胞骨架染色上可见细胞骨架轻微增大扩散。
　　结论：
　　给予兔纤维环源干细胞适当频率的拉伸刺激能够促进兔纤维环源干细胞合成基因及相关蛋白的表达，抑制分解代谢基因及相关蛋白的表达。

目录

声明

引言

材料与方法

1.实验材料

1.1主要试剂

1.2主要实验仪器

2.实验方法

2.1兔纤维环源干细胞的提取、培养和鉴定

2.2兔纤维环源干细胞的增值检测

2.3兔纤维环源干细胞表面干细胞蛋白检测

2.5硅胶拉伸皿的制作

2.6兔纤维环源干细胞不同频率的机械拉伸

2.7兔纤维环源干细胞基因表达分析

2.8兔纤维环源干细胞应用不同频率拉伸后形态观察

2.9 生化分析

3.统计学分析

结果

1.纤维环源干细胞的形态及增值情况

2.纤维环源干细胞的表面标记物的免疫荧光染色

3.纤维环源干细胞的三系诱导

4.纤维环源干细胞在不同频率周期性机械拉伸后基因表达分析

5.纤维环源干细胞在不同频率机械拉伸后细胞形态学分析

6.纤维环源干细胞在不同频率周期性机械拉伸后生物化学分析

讨论

结论

参考文献

英文缩略词表

致谢