Omega-3不饱和脂肪酸通过GPR120/β2-arrestin/TAK1/TAB1信号通路对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的抑制作用及其分子机制的研究

摘要

第一部分 omega-3预处理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的影响的实验研究
　　目的:
　　研究omega-3预处理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的影响。
　　方法:
　　实验一：评估预处理（灌胃鱼油）大鼠脑组织中EPA和DHA的含量。
　　1.动物分组：16只健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为4组（每组4只）：对照组，安慰剂组，灌胃鱼油2周组，灌胃鱼油3周组。接受鱼油预处理的实验组采取每24小时灌胃一次鱼油（主要含30％ omega-3），剂量为1g/kg体重。安慰剂组以同样的方法步骤接受等量的玉米油灌胃3周。
　　2.提取脑组织，进行脂质萃取及气相色谱分析，分析脑组织中DHA和EPA的含量。
　　实验二：研究鱼油预处理后对SAH后EBI病理过程的影响。
　　1、动物分组：60只成年健康雄性SD大鼠，随机分为4组，每组12只。假手术组， SAH组， SAH+安慰剂组，SAH+鱼油2周组。
　　2、动物模型制作：实验性蛛网膜下腔出血动物模型采用视交叉前池注血法。24小时后处死大鼠，灌注取脑并且留取颞底脑标本检查。
　　3、检测方法及指标：干湿重法测定各组大鼠脑水肿指数，TUNEL和FJB评估各组大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中细胞凋亡和神经元退变，Western blot检测各组大鼠脑组织中COX-2、MCP-1和iNOS的蛋白表达。
　　结果:
　　1、鱼油喂养2周和3周均可明显升高脑组织中DHA和EPA的含量（p<0.05）；鱼油喂养2周组和鱼油喂养3周组相比，DHA和EPA的含量无显著差异（p<0.05）。
　　2、蛛网膜下腔出血24小时后脑水肿明显（p<0.05），而鱼油预处理可减轻蛛网膜下腔出血后脑水肿（p<0.05）。
　　3、蛛网膜下腔出血后24小时候脑组织中TUNEL和FJB阳性细胞数明显增加（P<0.01），鱼油预处理可显著减少TUNEL和FJB阳性细胞（P<0.05）。
　　4、COX-2，MCP-1和iNOS的蛋白表达在SAH组中显著升高（P<0.01）；鱼油预处理则可显著下调COX-2，MCP-1和iNOS的蛋白表达（P<0.05）。
　　结论:
　　1、鱼油喂养可以有效地上调大鼠脑组织中DHA和EPA的含量，鱼油喂养2周即可达到最佳效果，在喂养2周的基础上延长1周喂养不能明显进一步升高大鼠脑组织中DHA和EPA的含量。
　　2、鱼油喂养预处理后脑细胞死亡和神经元退化显著减轻，脑组织中炎性因子的表达明显减少。
　　第二部分 omega-3预处理抑制SAH后EBI的作用机制的实验研究
　　目的:
　　探讨omega-3预处理对SAH后早期脑损伤的可能作用机制。
　　方法:
　　1、动物分组：60只成年健康雄性SD大鼠，随机分为4组，每组12只。假手术组， SAH组， SAH+安慰剂组，SAH+鱼油2周组。
　　2、动物模型制作：实验性蛛网膜下腔出血动物模型采用视交叉前池注血法。24小时后处死大鼠，灌注取脑并且留取颞底脑标本检查。
　　3、检测方法及指标：SAH建模24h后，对大鼠进行行为学评分，然后处死大鼠并取材。western blot检测GPR120在各组脑组织中的蛋白水平以及各组大鼠脑组织内TAK1，MEK4，JNK和IKK磷酸化水平。IP检测各组大鼠脑组织中GPR120/β-arrestin2结合、β-arrestin2/TAB1的结合以及TAK1/TAB1结合能力。EMSA检测各组大鼠脑组织中NF-κB活性。
　　结果:
　　1、SAH后脑组织中GPR120的蛋白表达明显下降（P<0.01）；而omega-3预处理能够抑制SAH引起的GPR120蛋白水平的降低（P<0.01）。
　　2、omega-3预处理可以显著增强GPR120与β-arrestin2以及β-arrestin2与TAK1的结合，并抑制TAK1与TAB1的结合（P<0.05）。
　　3、SAH后脑组织中TAK1，MEK4，JNK和IKK的磷酸化水平显著增加，而omega-3预处理可以显著抑制这些蛋白的磷酸化（P<0.05）。
　　4、经过omega-3预处理，SAH引起的NF-κB的活化被显著抑制（P<0.05）。
　　结论:
　　omega-3预处理可能通过GPR120/β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路抑制SAH后脑组织中MEK4，JNK和IKK的磷酸化和NF-κB的活化，从而抑制SAH后的免疫炎症反应。
　　第三部分 omega-3以GPR120依赖的方式减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤
　　目的:
　　进一步研究GPR120在omega-3影响SAH后EBI的β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路中的作用
　　方法;
　　1.实验动物分组：将24只SD大鼠随机分为3组。SAH+omega-3组， SAH+omega-3+Ctr siRNA GPR120组，SAH+omega-3+siRNA GPR120组。
　　2.各组大鼠在建立SAH模型前接受2周的鱼油灌胃。除SAH+omega-3组外，在建立SAH模型前48h分别接受siRNA或Ctr siRNA转染。应用视交叉前池注血法建立实验性蛛网膜下腔出血动物模型。24h后处死大鼠、灌注取脑并留取颞底脑组织标本进行相关检查。
　　3.检测指标：免疫荧光染色GPR120检测各组大鼠脑细胞凋亡。western blot检测各组脑组织中GPR120的蛋白表达水平以及各组大鼠脑组织内TAK1，MEK4，JNK和IKK磷酸化水平。TUNEL检测脑细胞死亡，FJB检测神经元退化。IP检测各组大鼠脑组织中β-arrestin2/TAB1以及TAK1/TAB1结合能力。EMSA检测各组大鼠脑组织中NF-κB活性。Western blot检测各组脑组织中免疫炎症因子COX-2，MCP-1和iNOS的蛋白水平。
　　结果:
　　1、在SAH+omega-3 fatty acids条件下，GPR120siRNA体内转染显著抑制大鼠脑组织内GPR120的蛋白表达（p<0.001）。
　　2、GPR120干扰使omega-3 fatty acids预处理促进β-arrestin2/TAB1结合的作用下降（p=0.003），抑制TAK1/TAB1结合的作用减弱（p=0.033）。
　　3、GPR120干扰减弱了omega-3fatty acids预处理抑制TAK1，MEK4，JNK和IKK磷酸化的作用（P<0.05），减弱了抑制NF-κB活性的作用（p=0.015）。
　　4、GPR120干扰减弱了omega-3 fatty acids预处理抑制脑细胞死亡的作用（p=0.017），减弱了抑制神经元退化的作用（p=0.041）。
　　5、GPR120干扰减弱了omega-3 fatty acids预处理抑制炎症反应的作用（p<0.05）。
　　结论:
　　1、omega-3可以通过其受体GPR120促进β-arrestin2/TAB1相互作用而竞争性抑制TAB1和TAK1的相互作用，进而抑制JNK和NF-κB通路以及脑细胞死亡和免疫炎症反应。GPR120siRNA体内转染可以有效地发挥其干扰作用。
　　2、omega-3以GPR120依赖的方式减轻SAH后EBI。
　　3、GPR120在β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路中的关键地位可能使其成为治疗SAH的新靶点。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 omega-3预处理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的影响

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 omega-3预处理抑制蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的作用机制

方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 omega-3以GPR120依赖的方式改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤

方法

结果

讨论

参考文献

综述:ω-3多不饱和脂肪酸在脑卒中的研究进展

中英文缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

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