变异型伴中央颞区棘波儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系及机制研究

摘要

一．变异型伴中央颞区棘波儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系研究
　　目的：分析变异型伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫(变异型BECT)与锌及代谢相关激素的相关性，探讨可行的早期干预措施，并改善变异型BECT的治愈率。
　　方法：1.选择在本院就诊的58例变异型BECT患儿作为实验组，选择典型BECT儿童120例作为对照组。两组患儿均于清晨空腹抽取5ml静脉血置于一次性使用生化采血管，采用BH5300S型钨舟原子吸收光谱仪检测全血微量元素浓度，采用罗氏发光仪(Cobas e601)检测代谢相关激素，贝克曼AU5800生化仪检测载脂蛋白，采用酶联免疫吸附（ELISA）测定血浆瘦素，同时抽静脉血2mL于一次性抗凝管中，采用细胞分析仪检测血常规。分析比较两组儿童血清微量元素、代谢相关激素、血常规、载脂蛋白及瘦素水平。
　　2.比较两组患儿头颅磁共振波谱、脑电图棘慢波指数的变化，采用中国修订韦氏儿童智力量表(WISC-R)作为评定工具，对两组儿童进行测试及评定。
　　结果：1.实验组儿童血清铁浓度,锌浓度以及血红蛋白浓度均明显低于对照组儿童(P<0.05)，实验组儿童血清铜离子浓度与对照组儿童比较，统计学比较差异无显著性意义(P>0.05)，实验组儿童载脂蛋白及瘦素水平与对照组比较，统计学比较差异无显著性意义(P>0.05)。实验组儿童血清(Gh,Cortisol,PTH,TSH)浓度明显下调，而血清（ACTH，FT3，FT4,25(OH)D）浓度明显上调。线性相关分析表明，锌与4种代谢相关激素显示正相关或负相关，8种代谢相关激素中有12对显示正相关或负相关，在总的36对中占44％。
　　2.实验组患儿头颅磁共振波谱NAA（N-乙酰天门冬氨酸）峰值降低，脑电图棘慢波指数较对照组明显增多，患儿认知功能明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。线性相关分析表明，锌及代谢相关激素与脑电图棘慢波指数、磁共振波谱及认知功能呈现正相关或负相关。
　　结论：实验组患儿微量元素锌,铁明显下调，血清(Gh,Cortisol,PTH,TSH)水平明显下调，而血清（ACTH，FT3，FT4,25(OH)D）水平明显上调,提示变异型 BECT与微量元素及代谢相关激素有较大的相关性，可能为变异型 BECT难以用常规抗癫痫药物有效治疗的原因之一，为临床工作者进一步研究变异型 BECT的早期干预措施，并改善变异型BECT的治愈率，提供了一个新的临床思路。
　　二．制作发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤模型
　　目的：建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型,观察并记录凋亡率和存活率,初步验证神经元损伤模型的可行性，以期为下一步干预提供模型。
　　方法：在体外原代培养10天的海马和大脑皮层神经元中分别加入不同浓度的谷氨酸(100、200、300、400μmol/ L),相差显微镜下观察细胞形态变化,用台盼蓝染色法检测存活率和TUNEL细胞凋亡技术检测凋亡率,以检测不同浓度谷氨酸对大脑海马神经元的损伤水平，找到建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型的最佳谷氨酸浓度。
　　结果：不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞6h后,可见部分细胞胞体肿胀，细胞轴突变短；1d后部分肿胀细胞裂解。采用台盼蓝染色法计算神经元存活率,结果发现各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元细胞凋亡,各种浓度的谷氨酸组神经元细胞与对照组神经元细胞比较，统计学有非常显著性差异( P<0.01),而且随着实验组谷氨酸浓度逐渐升高,神经元细胞的存活率也逐渐下降。TUNEL染色发现，不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞1d后,神经元细胞体积变小,细胞核固缩。各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元凋亡,与正常对照组比较，统计学有显著性差异( P<0.05)或非常显著性差异( P<0.01),在谷氨酸浓度为100﹑200μmol/ L时,神经元凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而上升,在谷氨酸浓度为200﹑300﹑400μmol/ L时，细胞凋亡率随着浓度的上升而下降。
　　结论：用上述方法培养的海马神经元状态很好,通过细胞免疫组化鉴定,纯度达到90%以上。在发育期惊厥诱导的神经元凋亡的实验中,当谷氨酸浓度为100﹑200μmol/L时,细胞凋亡率高而细胞死亡率并不高,提示100﹑200μmol/L的谷氨酸为诱导神经元凋亡的最佳浓度。
　　三．锌及其螯合剂对发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤的影响及机制研究
　　目的：检测锌离子及其螯合剂对发育期惊厥诱导的神经元损伤的影响及机制,为新生期惊厥提供新的治疗靶点。
　　方法：建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型，应用台盼蓝染色法、免疫组织化学、TUNEL细胞凋亡检测和荧光定量PCR等技术,在ZnSO4组中加入ZnSO4(50umol/l), TPEN（锌离子螯合剂）组加入TPEN(2.5umol/l)，检测TPEN对发育期惊厥诱导神经元损伤的保护作用，观察细胞凋亡基因caspase-3、抑凋亡基因Bcl-2及锌转体（ZnT-1, ZnT-2, ZnT-3）表达水平变化。
　　结果：100μmol/ L的谷氨酸可引起神经元存活率下降,加入TPEN的实验组细胞存活率明显高于未加入TPEN的对照组细胞（P<0.05, P<0.01）;100μmol/L的谷氨酸可引起神经元凋亡,加入TPEN的实验组细胞凋亡率明显低于未加入TPEN的对照组细胞（P<0.05, P<0.01）；100μmol/ L的谷氨酸可引起caspase-3阳性细胞率增加,加入TPEN的实验组caspase-3阳性率明显下调，而抑凋亡基因Bcl-2及锌转运体ZnT-1, ZnT-2明显上调（P<0.05,P<0.01）。
　　结论：加入TPEN预处理海马与皮层神经元后,细胞存活率和抑凋亡基因Bcl-2上调，细胞凋亡率和caspase-3基因表达下调,提示TPEN对发育期惊厥导致的神经元损伤有保护作用,可能是通过促进ZnT-1, ZnT-2的上调，抑制锌离子内流，促使凋亡基因caspase-3表达下调和抑凋亡基因Bcl-2上调，缩小凋亡通路，减少细胞凋亡发生,从而对发育期惊厥诱导的神经元损伤起到保护作用。

目录

声明

第一部分 变异型伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系研究

前言

一．资料与方法

二、结 果

三、讨 论

四、结 论

参考文献

第二部分 发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤模型的建立

前言

材料和方法

结果

结论

参考文献

附图

第三部分 锌及其螯合剂对发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤的影响及机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述：锌稳态在惊厥性脑损伤中的作用及研究进展

论文创新之处与不足

附录

攻读学位期间公开发表的论文及承担课题

致谢