右美托咪定预处理抑制RyR2磷酸化减轻H9C2心肌细胞氧糖剥夺/复氧损伤

摘要

目的：心肌缺血/再灌注损伤是一种常见的复杂生理病理过程，而Ca2+调控紊乱是导致缺血再灌注后心肌功能障碍和细胞损伤的重要原因之一。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex) 作为一种临床常用的镇静镇痛药，其器官保护作用近年来被越来越多的研究者报道。在心肌缺血再灌注损伤中，已经证明 Dex 可以通过抑制ROS及激活抗炎通路等途径发挥保护保用，而它是否可以通过调节钙平衡来减轻缺血再灌注心肌的损伤，目前尚不清楚。本研究旨在探究Dex预处理对H9C2细胞氧糖剥夺/复氧 (Oxygen Glucose Deprivation/Reperfusion, OGD/R) 损伤模型中钙离子的影响及其相关分子机制。 方法： 1、选用H9C2细胞，采用缺氧小室对细胞进行OGD 24 h的处理，随后复氧3 h，建立OGD/R模型；Dex预处理组细胞在OGD前经不同浓度Dex (0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L) 预处理1 h，其余处理同OGD/R组；对照组细胞常规培养。 2 、 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 ， 应 用 甲 基 噻 唑 蓝[ 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT ] 法检测各组细胞活力，应用 2 ， 4-二硝基苯肼显色法检测培养基乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase ，LDH) 释放率，应用钙成像方法检测细胞内钙浓度水平。 3、应用real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 法检测FKBP12.6基因mRNA表达情，Western Blotting检测钙调控相关蛋白RyR2的表达及磷酸化状态的改变，以及FKBP12.6和凋亡因子Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白水平的表达变化。 4、采用FKBp12.6 siRNA对细胞进行基因沉默，检测其是否能反转Dex的保护作用。 结果： 1、OGD/R 处理能明显降低细胞活力， 增加 LDH 释放率及细胞内钙浓度，使细胞损伤加重、凋亡增多。 2 、OGD/R降低FKBP12.6在mRNA及蛋白水平的表，上调凋亡因子cleaved Caspase-3的蛋白水平，对RyR2蛋白表达无明显影响，但在S2814位点磷酸化明显增加。 3、Dex能显著改善OGD/R细胞活力，降低LDH释放率及细胞内钙浓度，且此效应与Dex的浓度相关，以终浓度1 μmol/L时为最佳；同时Dex使 FKBP12.6在mRNA及蛋白水平的表达均明显回升，并抑制RyR2蛋白在S2814位点的过度磷酸化，降低凋亡因子cleaved Caspase-3的表达。 4、基因沉默 FKBP12.6 能反转 RyR2 蛋白在 S2814 位点的磷酸化和 cleaved Caspase-3的表达，明显抑制Dex对细胞的保护作用。 结论：Dex预处理可以减轻H9C2细胞OGD/R损伤，其机制可能与增加钙调控相关分子FKBP12.6的表达、减少RyR2的磷酸化从而抑制钙超载有关。

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