巨噬细胞固相色谱法的建立及其在虫草免疫活性物质研究中的应用

摘要

中药有几千年的应用历史，临床效果确切。然而长期以来，由于中药的效应物质基础不明，临床应用多凭经验，造成中药的质量标准研究、作用机制研究、药代动力学和毒理学研究等各项基础研究变得十分困难，严重阻碍了中药现代化。
　　 在效应物质的研究中，传统方法是将中药中的各种成分采用化学手段分离出来，然后逐一用动物模型验证各个成分的效应。这类方法步骤繁琐、成本高、劳动强度大且成功率不高。有鉴于此，人们发展了各种高通量研究方法.这些方法包括80年代的利用受体分子、酶等分离筛选中药中的活性成分；90年代的分子生物色谱法，采用将人血清白蛋白等固定在色谱担体中，研究药物分子与生物大分子的相互作用；其后出现细胞膜生物色谱法、模拟生物膜色谱法、细胞生物色谱法，等等。将受体分子保留在完整的细胞膜中有利于维持生物大分子的活性，这是对分子生物色谱法的改进，由于在这些研究中，细胞膜或细胞仍然要固定在硅胶或凝胶颗粒中，因此也并非真正完整保持生物活性的细胞膜或活细胞。在这种情况下，我们发展了细胞(膜)固相色谱法，同时满足细胞(膜)的生物活性和色谱分离要求，用于研究中药中的效应物质。
　　 本文第-部分第3点内容，概述了本室这方面的研究工作情况。上述这些研究方法主要都是利用药物分子与受体、酶等生物大分子的特异性亲和作用来分离分析中药中的效应成分.由于受体等生物大分子的活性受环境的影响较大，因此越接近实际生理状态的受体，其功能保存得越完全，在我们的研究中即在分析效应成分的同时保证了细胞(膜)生存的环境。
　　 冬虫夏草是传统的补益中药，虫草菌粉是从天然虫草中分离出虫草真菌，经培养、发酵得到菌丝体，再经过焙干研粉而得到的菌粉。一般认为，人工培养虫草与天然虫草的化学成分和药理效应相似，因此多将人工虫草用作天然虫草的代用品，用以缓解日渐紧张的天然虫草资源。现代的临床和药理学研究表明虫草具有广泛的免疫调节作用，能够作用于免疫系统的多个方面。但是，在文献报道中经常出现研究结果不太一致的情况，这可能与虫草来源、制备方法、动物品系、模型生理病理状态以及检测手段不同有关，可能会导致实验结果的不同，这使得虫草的功效研究包括效应物质基础研究陷入一定的困境。因此，如何采用既接近实际作用机制，又具有高效率的实验研究方法，是效应物质研究中亟待解决的问题。效应成分通常是作用于细胞上的效应靶点发挥作用的，虫草的效应，可能是通过作用于免疫细胞发挥作用的；在各种免疫细胞中，巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成部分，具有吞噬、杀伤、递呈抗原、分泌生物活性物质、调控局部组织微环境等多种功能，是机体非特异防御的基础.巨噬细胞不仅是先天性免疫中重要的细胞群，在特异性获得性免疫中也发挥着重要作用，可以说，巨噬细胞几乎影响着免疫系统的方方面面.同时，巨噬细胞价廉易得，因此我们免疫活性成分的固相色谱研究中选择了巨噬细胞。由于虫草对免疫系统具有多方面的影响，因此可能会与巨噬细胞发生作用，文献中也常出现虫草及其提取物影响巨噬细胞吞噬功能的报道。以现代药理学理论推测，虫草中的某些效应成分能够作用于巨噬细胞上的受体，从而发挥效应，影响巨噬细胞的功能活动。我们可以利用效应成分与巨噬细胞的这种结合作用，将它们从中药提取物中分离出来，并结合一定的检测和鉴定方法，明确这些成分.这是本论文第一部分中所阐述的假说形成过程。
　　 第二部分内容重点讲述巨噬细胞固相色谱的研究过程，是整部论文的核心.第二部分第一章中的内容主要是采用RP-HPLC法，研究了十种虫草样品水提液的成分谱，确定了检测波长260 nm、检测时间30 min，优化了其他色谱分析条件，考察了仪器分析的精密度。在确定的检测方法下分析了虫草样品液的成分谱，为下面进一步研究其中的效应成分打下基础.在这些成分中，多数是核苷类成分，不同的虫草样品核苷的种类和含量是有差异的，根据比较分析，综合考虑，我们选择江西国药的虫草菌粉作为下一步研究的工具药。第二章里探讨了巨噬细胞分离效应成分的可能性，建立巨噬细胞固相色谱法，研究免疫相关活性成分。研究采用虫草提取液，观察了其中几种主要的核苷类成分与巨噬细胞的作用情况，发现两种核苷可以被巨噬细胞明显“固定”。在成分鉴定中，我们采用光谱扫描、标准品加样对照、质谱分析，并结合文献研究，确定这两个成分是腺苷和鸟苷。腺苷是药典中虫草含量测定的指标性成分，而鸟苷不是，因此本方法在探索效应成分，完善中药质量标准方面体现了应用前景。为了进一步明确这种结合作用，同时避免中药提取物中无关成分的干扰，我们采用了核苷标准品进行实验；为了研究不同种属的巨噬细胞，我们还进行了小鼠巨噬细胞的“固相”研究，结果显示：标准品与虫草样品溶液中的相应核苷类成分均能与巨噬细胞发生，大鼠和小鼠的巨噬细胞研究结果也相似。被结合成分的效应如何将在后面的效应实验中加以验证，为了排除生物膜的非特异性吸附作用，第三章里我们选择SMMC-7721人肝癌细胞株、热处理巨噬细胞、紫外线照射细胞以及拮抗剂茶碱作用后的细胞进行结合作用研究。研究结果表明：相关核苷类成分在所考察时间内不与SMMC-7721细胞发生明显结合作用，这可能是与细胞受体种类不同有关；这些核苷类成分也不与或极少与热处理巨噬细胞和紫外线照射细胞发生结合作用，这可能与细胞受损后受体活性降低有关，而腺苷受体拮抗剂茶碱可以很明显的拮抗虫草中腺苷的结合作用。第四章，我们研究了前述被巨噬细胞“固定化”的成分对巨噬细胞功能的影响。巨噬细胞能够分泌多种细胞因子，这些细胞因子的改变也能够反映巨噬细胞功能活动的变化，因此在本章第一节中我们采用ELISA方法检测TNF-α、IL-1β，采用Griess法检测NO等方法，观察“固定”核苷成分与巨噬细胞共培养后对巨噬细胞功能活动的影响。由于天然虫草与人工虫草的含量差异，因此我们同时评价了不同比例核苷的效应，结果腺苷和鸟苷更多的表现出来的是对巨噬细胞的抑制效应，而尿苷有轻微的激活效应；还证明了核苷类成分即便种类相同，如果含量比例不同，对细胞也会产生不同的作用。第四章第二节观察了腺苷、鸟苷和尿苷对巨噬细胞吞噬功能的影响，结果腺苷和鸟苷仍然表现抑制作用而尿苷有轻微促进作用，
　　 第三部分对本研究的思路形成过程、假说的提出和论证过程进行了讨论，对下一步工作进行了展望，并涉及关于现有方法的一些存在问题。同时，对于如何实现细胞固相过程与仪器分析的联用实现高通量、自动化分析，我们给出了一个初步的设计方案。文章最后是与研究有关的文献综述内容。
　　 总结全文，我们认为采用巨噬细胞分离分析虫草中的免疫活性物质是可行的，本研究为采用类似方法分析研究中药中的效应物质提供了依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分绪论(假说的提出)

第二部分虫草提取液的巨噬细胞固相色谱研究

第一章虫草水提液在RP-HPLC紫外检测条件下的成分谱研究

第二章虫草水提液的巨噬细胞固相色谱研究

第一节巨噬细胞固相色谱分析

第二节巨噬细胞结合分离成分的鉴定

第三节标准品加样研究巨噬细胞结合作用

讨论

小结

参考文献

第三章巨噬细胞固相色谱研究中特异性结合作用的验证

第四章巨噬细胞固相色谱特异性结合成分的药理活性研究

第一节核苷类成分对巨噬细胞分泌细胞因子的影响

第二节核苷样品对大鼠巨噬细胞吞噬中性红实验的影响

参考文献

第三部分讨论与展望

文献综述

附件 个人简历

致谢

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