舌苔形成的基因表达谱和EGF-R相关信号通路机制研究

摘要

目的： 舌诊在中医临床疾病诊断中起着重要作用，其中舌苔（包括苔色和苔质）在辨证中的价值最大，舌苔形成的原理及其客观化研究是中医现代化基础研究中的一个重大的关键性课题。舌苔的形成与舌粘膜上皮细胞的分裂，增殖、分化、迁移和脱落密切相关，与凋亡相关基因的表达差异密切相关。因此，本文从临床样本和实验动物两个方面，研究了不同舌苔粘膜组织的基因表达谱，探索EGF和TGF-α对舌背粘膜上皮细胞增殖、细胞周期分布和凋亡，信号途径相关分子的影响，为更深入研究舌苔形成的分子机制奠定了基础。 方法： 临床收集舌鳞癌患者术后癌周正常舌背粘膜，分为薄白苔、白厚苔、黄薄苔、黄厚苔、剥苔等5组，以胎儿薄白苔对照，利用基因芯片技术联合实时荧光定量PCR研究不同舌苔的基因表达谱。 取临床舌鳞癌患者术后癌周正常舌背粘膜组织作为对照，健康的大鼠、小鼠和兔处死后取舌背粘膜组织，dispaseⅡ和胰蛋白酶处理分离舌背粘膜上皮细胞，体外10％血清的RPMI-1640培养基培养不同时段，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。分析人和实验动物舌背粘膜上皮细胞的细胞行为相似性，研究EGF对小鼠、大鼠、兔的细胞周期分布和凋亡影响。 在无血清培养基K-SFM中，初步研究了EGF和TGF-α调控舌苔形成的差异机制，利用MTT法研究大鼠舌背粘膜上皮细胞增殖活性，流式细胞术研究细胞周期分布和凋亡，细胞免疫组织化学法研究CK4、p38-MAP kinase、c-fos、c-myc和NF-κB的表达水平。 结果： 基因表达谱结果显示，与胎儿薄白苔相比，60个基因在5种常见舌苔中同时表达上调或下调，包括21个上调基因和39个下调基因，这些基因均与舌背粘膜上皮细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和脱落相关，参与舌背粘膜上皮的损伤、修复和重建。 人、大鼠、小鼠、兔的舌背粘膜上皮细胞周期分布和凋亡比较显示，大鼠舌背粘膜上皮凋亡趋势与人最为接近。利用含血清培养基培养大鼠、小鼠、兔的舌背粘膜上皮细胞，结果表明：EGF对小鼠和兔舌背粘膜上皮细胞均表现为抗凋亡作用，但不显示浓度依赖性：此外，EGF和TGF-α可以促进大鼠舌背粘膜上皮细胞凋亡发生，且细胞周期分布不一致。 利用含不同浓度EGF和TGF-α的无血清培养基K-SFM体外培养大鼠舌背粘膜上皮细胞，随着时间推移，细胞增殖活性逐渐下降，与细胞凋亡率变化基本一致。细胞凋亡率具有浓度依赖性，随着EGF和TGF-α的浓度升高，细胞凋亡率表现为下降趋势。EGF和TGF-α可以降低CK4的表达水平，其中1μg/L和10μg/L浓度表达水平下降最明显，而5μg/L EGF和TGF-α对CK4表达水平下降较少；EGF和TGF-α可以上调p38-MAP kinase、c-myc和c-fos表达水平，却下调NF-κB表达水平；不同浓度EGF和TGF-α对相关分子表达影响具有相同的趋势，但相同浓度作用后相关分子表达量不同。EGF上调大鼠舌背粘膜上皮细胞p38-MAP kinase和c-myc的作用强于TGF-α，而EGF上调c-fos的作用弱于TGF-α；EGF下调NF-κB p65和p50的作用不如TGF-α更明显，从阳性目标平均光密度值看，NF-κB p50的表达水平高于NF-κBp65。 结论： 在参与舌苔形成的基因中，EGF和TGF-α是两个关键分子，虽然它们可以竞争性结合共同的细胞受体EGF-R，但对细胞周期分布和凋亡的影响不同，提示它们在舌苔形成中的功能不同。 以大鼠舌背粘膜上皮细胞作为体外细胞模型，研究EGF和TGF-α对p38-MAPkinase、c-myc、c-fos和NF-κB等信号通路分子的表达水平，结果显示EGF和TGF-α对这些分子表达水平的变化趋势基本一致，但表达水平明显不同。因此，我们推测：在正常人群和不同疾病患者的舌苔形成过程中，EGF和TGF-α是影响舌苔变化的两个关键分子，可能通过多种信号通路调控舌背粘膜上皮细胞的增殖、分化、迁移、角化成熟和凋亡脱落。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述 凋亡相关基因调控舌苔形成的分子机制研究进展

前言

1凋亡相关基因表达研究

2凋亡相关基因的信号途径与舌苔变化的关系研究

3舌苔形成分子机制研究中存在的问题

4展望

第二章不同舌苔粘膜组织的基因表达谱研究

前言

1材料与仪器

1.1标本

1.2主要试剂

1.3主要仪器和设备

2实验方法

2.1总RNA提取

2.2探针标记与杂交

2.3实时荧光定量RT-PCR验证4个基因在不同舌苔粘膜中的表达

3结果

3.1 cDNA的制备和纯化

3.2基因芯片检测结果

3.3实时荧光定量PCR验证4个基因在不同舌苔中的表达

4讨论

4.1 TGF-α、EGFR和舌苔形成的关系

4.2 IL-1Ra和舌苔形成的关系

4.3 NF-κB、MYC和舌苔形成的关系

4.4物质能量代谢相关蛋白和舌苔形成的关系

4.5细胞连接相关蛋白和舌苔形成的关系

第三章人、小鼠、大鼠、兔舌背粘膜上皮细胞的凋亡和周期变化比较研究

前言

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.2样本

1.3方法

2结果

2.1舌背粘膜上皮细胞的鉴定

2.2细胞周期和凋亡变化分析

3讨论

第四章EGF调控小鼠和兔舌背粘膜上皮细胞的细胞周期和凋亡初步研究

前言

1材料与方法

1.1动物

1.2主要试剂和仪器

1.3 EGF对舌背粘膜上皮细胞的作用

1.4流式细胞术检测细胞周期和凋亡

1.5统计学处理

2结果

2.1 EGF对小鼠舌背粘膜上皮细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响

2.2 EGF对兔舌背牯膜上皮细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响

3讨论

第五章EGF和TGF-α影响大鼠舌背粘膜上皮细胞的细胞周期和凋亡比较研究

前言

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.2动物

1.3方法

2结果

2.1 EGF和TGF-α对细胞增殖的影响

2.3 EGF和TGF-α对大鼠舌背粘膜上皮细胞周期分布和凋亡的影响

3讨论

第六章EGF和TGF-α影响大鼠舌背粘膜上皮细胞的信号途径初探

前言

1材料与试剂

1.1主要试剂和仪器

1.2动物

2方法

2.1舌背粘膜上皮细胞的分离和培养

2.2MTT检测细胞增殖活性

2.3细胞培养与流式细胞仪检测

2.4细胞免疫组织化学检测

2.5免疫组织化学数据处理

2.6统计学处理

3结果

3.1大鼠舌背粘膜上皮细胞在K-SFM培养基中的生长

3.2 EGF和TGF-α对细胞增殖的影响

3.3 EGF和TGF-α对大鼠舌背粘膜上皮细胞周期分布和凋亡的影响

3.4 EGF和TGF-α对大鼠舌背粘膜上皮细胞CK4、p38-NAP kinase、c-myc、c-fos和NF-κB等信号通路分子表达的影响

4讨论

4.1 EGF和TGF-α对大鼠舌背粘膜上皮细胞增殖活性、细胞周期分布和凋亡的作用

4.2 EGF和TGF-αa对大鼠舌背粘膜上皮细胞角化成熟的影响

4.3 EGF和TGF-α对大鼠舌背粘膜上皮细胞p38-NAP k i naso、c-myc、c-los和NF-KB等信号通路分子表达的影响

全文小结

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介