蛇床子素骨靶向药物的合成及体外调节OPG/RANKL系统抗骨质疏松的实验研究

摘要

目的：应用水溶性壳聚糖衍生物(NSC)为骨靶向载体，合成蛇床子素骨靶向新型化合物(NSC-OST);观察NSC-OST对大鼠体外培养成骨细胞(Osteoblast，OB)的增殖及骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配基(RANKL)表达的影响，观察NSC-OST对破骨细胞(Ostcoclast，OC)数量及骨吸收功能的影响，初步探讨其作用机制。
　　 方法：①通过物理包埋、综合透析等方法，制备蛇床子素骨靶向药物。②取新生大鼠颅盖骨进行OB分离培养。培养7d后采用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定OB，培养14d后采用茜素红染色法鉴定OB;随机将OB分为5组，即空白对照组及终浓度为10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/LNSC-OST组，分别加入不同浓度的NSC-OST作用不同时间，用MTT法检测成骨细胞增殖情况。不同浓度的NSC-OST作用成骨细胞7d，采用ELISA法检测药物成骨细胞OPG、RANKL的表达。③取新生乳大鼠股骨分离OC分离培养。分组及干预方法同前，培养7d后采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞并进行阳性细胞计数；利用甲苯胺蓝对骨吸收陷窝染色并在图像分析仪上测定骨吸收陷窝的面积。
　　 结果：①本研究成功合成了具有壳聚糖衍生物结构的N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC)，并成功制备了NSC-OST。②体外分离培养的细胞具有典型成骨细胞形态学及生物学活性，碱性磷酸酶、茜素红染色均呈阳性结果；作用24h、48h、72h终浓度为10-5mmol/LNSC-OST可促进OB增殖(P＜0.05)，作用72h，终浓度为10-6mmo/L可促进OB增殖(P＜0.05)；终浓度为10-4mmol/LNSC-OST具有明显抑制OB增殖的作用(P＜0．01)。终浓度为10-6mmo/L和10-5mmol/L组促进成骨细胞OPG的表达、抑制RANKL的表达；终浓度为10-6mmol/L、10-5mmol/L组可显著上调OPG/RANKL的比值(P＜0.01)。③分离培养的细胞与OC相似，TRAP染色可见胞浆呈酒红色；加药培养48h，10-5mmol/L、10-4mmol/L组破骨细胞数量低于空白组(P＜0.05)，10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/L组骨吸收陷窝面积低于空白组(P＜0.05);96h时，不同浓度的NSC-OST组破骨细胞和骨陷窝面积均低于空白对照组(P＜0.05，P＜O.01)，10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmo/L组组间骨吸收陷窝面积差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：①本研究以水溶性壳聚糖衍生物(NSC)为骨靶向载体，成功制备并表征了蛇床子素壳聚糖衍生物胶束，其具有较好的水溶性，有利于顺利达到药物的有效治疗浓度及治疗部位；②适当浓度的NSC-OST可以促进成骨细胞的增殖及OPG的表达，抑制RANKL的分泌，同时能降低破骨细胞的数量，减少骨吸收陷窝的面积，从而达到抗骨质疏松的目的，可为研发靶向选择性高、局部作用强的新型抗骨质疏松药提供有益参考。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 蛇床子素骨靶向药物的合成

实验一 两亲性壳聚糖衍生物N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC)的制备

1 实验目的

2 试剂与仪器

3 实验方法与结果

4 讨论

实验二 蛇床子素壳聚糖衍生物胶束(NSC-OST)的制备

1 实验目的

2 仪器与试剂

3 实验方法与结果

4 讨论

第二部分 实验研究

实验一 NSC-OST对体外培养大鼠成骨细胞功能的影响

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法与步骤

4 统计分析

5 结果

6 讨论

7 小结

实验二 NSC-OST对体外培养大鼠破骨细胞功能的影响

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法与步骤

4 统计分析

5 结果

6 讨论

7 小结

第三部分 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢