半夏、掌叶半夏中凝集素蛋白促炎作用及矾制解毒机理研究

摘要

本学位论文得到国家自然科学基金—天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性和炮制的影响(NO.81173549)、国家自然基金项目——天南星科有毒中药矾制解毒共性规律研究(NO.30973939)、国家“十一五”科技部支撑计划课题——复制法炮制解毒共性技术和相关设备研究(NO.2006BAI09B06-10)的资助。
　　 半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的块茎，掌叶半夏为天南星科植物掌叶半夏PinelliapedatiectaSchott的干燥块茎，同科同属，均为有毒中药，其毒性主要表现均是对口腔、咽喉及皮肤粘膜的强烈刺激性。课题组前期研究表明，半夏、掌叶半夏刺激性毒性成分均为具特殊晶型的“毒针晶”，具倒刺、凹槽、可弯曲，具韧性。毒针晶可引起家兔眼结膜强烈水肿，大鼠足趾肿胀等强烈的炎症刺激性毒性。研究结果表明大量细长、质地柔韧、两端尖而锋利的针状样晶体可刺入机体组织，引起刺激疼痛感并产生炎症反应。毒针晶是一种主要由草酸钙、蛋白等组成的复合物。进一步研究发现半夏及掌叶半夏毒针晶蛋白中均含有凝集素蛋白。并发现半夏凝集素蛋白可诱导大鼠腹腔中性粒细胞迁移，引起大鼠足跖肿胀，具有显著的促炎效应，其促炎作用表现与毒针晶引起的炎症刺激性毒性极为相似。同科同属的掌叶半夏凝集素是否与半夏凝集素有相似的促炎活性？未见有报道。且半夏及掌叶半夏凝集素蛋白的促炎效应与毒针晶毒性的相关性研究也不尽深入。
　　 半夏及掌叶半夏因其具显著的刺激性毒性，临床上均主要使用其炮制品。《中国药典》记载半夏炮制品有清半夏、姜半夏及法半夏，其中清半夏及姜半夏均使用相同的辅料白矾；掌叶半夏是临床天南星的代用品，也大多采用辅料白矾炮制。其他天南星科毒性中药天南星、白附子在复制法炮制工艺中均需加入白矾至口尝稍有或无麻辣味。课题组前期研究结果显示白矾（主要含十二水硫酸铝钾）是复制法减毒的共性炮制辅料，其炮制作用主要是降低其刺激性毒性，故将白矾炮制称为矾制。白矾溶液可以破坏毒针晶的特殊晶型，使得毒针晶逐渐被锈蚀，推测其作用可能是白矾溶液中的三价铝离子络合毒针晶中草酸根离子，使得毒针晶不溶性草酸钙溶解，针晶刚性支撑的物质基础被破坏，从而毒性降低，但未经实验证实，国内外也未见有报道。同时白矾溶液是否对毒针晶中的化学刺激物凝集素蛋白产生某种作用导致其化学刺激性下降，国内外也未有研究。
　　 本学位论在在本课题组前期对半夏、掌叶半夏毒性成分和炮制减毒机理研究的基础上，进一步以半夏及掌叶半夏的毒性成分毒针晶及凝集素蛋白为研究对象，深入研究凝集素蛋白促炎作用及其与毒针晶毒性的相关性，深入研究矾制对半夏、掌叶半夏毒针晶结构、组成及刺激性的影响，揭示复制法矾制解毒机理，主要工作内容和研究结果包括以下几方面：
　　 1.半夏及掌叶半夏凝集素促炎作用研究
　　 为了进一步研究半夏、掌叶半夏凝集素蛋白的促炎作用，采用小鼠腹腔炎症模型，考察半夏及掌叶半夏凝集素蛋白促炎作用的量-毒效应及时-毒效应；采用家兔眼结膜刺激模型和小鼠腹腔炎症模型，考察半夏及掌叶半夏凝集素蛋白与毒针晶毒性的相关性。研究结果表明：半夏凝集素、掌叶半夏凝集素均可引起大鼠腹腔渗出液中PGE2、蛋白含量显著提高，并呈剂量依赖性；半夏及掌叶半夏凝集素蛋白均可显著加重毒针晶对家兔眼结膜的刺激性，且随着凝集素浓度的升高，眼结膜炎症肿胀显著增强，但单给药凝集素对家兔眼结膜无刺激性。此结果表明，半夏、掌叶半夏凝集素蛋白具强烈的促炎作用，其促炎作用与毒针晶的刺激性炎症毒性密切相关。半夏、掌叶半夏产生强烈炎症刺激的机制是毒针晶刺入机体，凝集素蛋白随针晶刺入而进入机体组织，诱导炎症反应发生而产生严重的刺激性毒性。
　　 2.矾制对半夏、掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白所致炎症刺激性毒性的影响
　　 采用家兔眼结膜刺激模型和小鼠腹腔炎症模型考察矾制对半夏、掌叶半夏毒针晶及凝集素致炎作用的影响。研究结果表明：毒针晶经8％白矾炮制后可以显著降低对家兔眼结膜的刺激性，半夏及掌叶半夏凝集素蛋白经8%白矾炮制后，小鼠腹腔渗出液中蛋白、PGE2含量也显著降低，与未处理组相比，呈显著性差异。此结果说明：矾制可以显著降低半夏、掌叶半夏毒针晶的致炎及凝集素蛋白的促炎效应。
　　 3.矾制对半夏及掌叶半夏毒针晶结构、毒针晶蛋白组成及掌叶半夏凝集素的影响
　　 采用电镜扫描技术研究半夏、掌叶半夏毒针晶在矾制过程中晶型的变化；以27Al-NMR分析研究白矾溶液炮制针晶后的上清液中存在的铝离子的形态，考察白矾溶蚀针晶结构是否与三价铝离子络合毒针晶中草酸根离子相关；采用SDS-PAGE电泳方法研究矾制对半夏、掌叶半夏凝集素及毒针晶蛋白的影响；对矾制毒针晶上清液中的蛋白电泳条带进行胶内酶解后质谱分析、蛋白数据库比对搜索，分析矾制过程中蛋白肽序列的变化。结果显示，电镜扫描图可见半夏、掌叶半夏毒针晶在矾制过程中针晶的晶型和结构被破坏；27Al-NMR分析，与空白对照，半夏、掌叶半夏毒针晶经矾制后上清液均在化学位移δ=6.00ppm左右处出现新的峰，以对照品对照，显示Al3+与毒针晶中的C2O42-形成的是单配体络合物。
　　 半夏、掌叶半夏凝集素蛋白矾制前后电泳条带未见明显变化；毒针晶经白矾浸泡后的上清液中检测到凝集素蛋白,且其分子量未见明显变化，肽序列质谱分析及比对结果显示，未处理的半夏及掌叶半夏毒针晶蛋白条带中均检测到11条凝集素蛋白序列，与NCBI蛋白质库中凝集素前体蛋白序列的比对，显示分别比对到11条和9条，比对率较高；半夏、掌叶半夏毒针晶矾制上清液中的蛋白条带中分别检测到24和17条肽段序列，其中分别有6条和4条与相对应的未处理毒针晶组相同，表明白矾浸泡针晶后上清液确实存在凝集素蛋白，说明白矾溶液可以使得毒针晶上的凝集素蛋白溶解于上清液中，但与NCBI蛋白质库中凝集素前体蛋白序列的比对，显示上清液中半夏凝集素比对到8条序列，掌叶半夏凝集素只比对到3条序列，比对率相较于未处理组明显下降，表明半夏、掌叶半夏毒针晶中的凝集素蛋白被溶解的同时，白矾溶液还使得凝集素蛋白发生降解。矾制后毒针晶上蛋白含量下降。白矾溶液中Al3+络合草酸根，使毒针晶溶解，白矾使毒针晶上毒蛋白溶解降解，两种作用均可导致半夏及掌叶半夏毒针晶及块茎的毒性显著下降。
　　 通过上述研究表明，半夏、掌叶半夏共性的毒性成分毒针晶及凝集素蛋白，其诱导炎症反应的作用相似。凝集素蛋白具有显著的致炎作用并存在量-毒、时-毒关系，并且可以协同毒针晶产生更加严重的炎症反应，进一步证明了半夏及掌叶半夏的毒性是毒针晶产生的机械刺激与化学刺激性双重作用的结果。半夏、掌叶半夏复制法矾制减毒机制为，白矾溶液中的Al3+可络合毒针晶草酸钙中的草酸形成单配体络合物，使草酸钙溶解，针晶的刚性结构破坏；同时白矾溶液可使针晶中凝集素蛋白溶解并降解在浸泡的溶液中，在破坏其特殊的针晶晶型同时降低了化学刺激，毒性显著降低。白矾作为半夏及掌叶半夏共性的炮制辅料，其炮制减毒机制存在共性。
　　 本学位论文对半夏、掌叶半夏毒性机制研究及矾制减毒机理研究得出的结果将为天南星科有毒中药炮制减毒机理研究及炮制工艺改进及创新提供理论依据，同时将对天南星科有毒中药饮片的生产和临床安全有效的使用奠定基础。

目录

声明

摘要

前言

第一章 天南星科有毒中药复制法矾制解毒研究进展

参考文献

第二章 27AINMR分析技术及其应用

参考文献

第三章 半夏、掌叶半夏凝集素促炎作用及与毒针晶毒性的相关性研究

第一节 半夏凝集素蛋白与半夏毒针晶毒性的相关性研究

参考文献

第二节 掌叶半夏凝集素蛋白与掌叶半夏毒针晶毒性的相关性研究

参考文献

第四章 矾制对半夏、掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白所促炎症刺激性毒性的影响

参考文献

第五章 半夏、掌叶半夏矾制减毒机制研究

第一节 矾制对半夏及掌叶半夏毒针晶结构的影响及其机制研究

第二节 矾制对半夏及掌叶半夏毒针晶蛋白的影响

参考文献

结语

攻读硕士学位期间取得的成果

致谢