新型重组人血管内皮抑素联合榄香烯注射液治疗恶性腹水的实验研究

摘要

研究背景和目的：
　　 恶性腹腔积液（简称恶性腹水）是临床常见的肿瘤终末期事件，它严重影响患者的生活质量和生存时间，目前的常规治疗虽然一定程度上可以缓解症状，但是具有明显的局限性，远期疗效不尽人意，因而急需探索治疗恶性腹水的新药物、新手段。业已证实，腹膜微血管通透性增加和肿瘤新生血管形成是恶性腹水形成的重要原因，血管内皮生长因子(VEGF)是刺激血管生成和增加血管渗透性的关键因子，通过干预相关环节，有望为治疗恶性腹水提供新的途径。新型重组人血管内皮抑素——恩度(rh-Endastatin，Endostar(R))，是一种内源性的血管形成抑制因子，通过多靶点的抗血管生成作用抑制肿瘤的生长。榄香烯注射液（以下简称榄香烯）是从中药莪术中提取的萜烯类抗肿瘤制剂，临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤以及腔内给药治疗恶性胸腹水。因此，本实验旨在探讨恩度联合榄香烯治疗小鼠恶性腹水是否可以起到协同增效作用，并进一步研究其作用机制，为恩度联合榄香烯治疗恶性腹水的临床实践提供可靠的实验室依据。
　　 方法：
　　 1.体内实验:(1)在正常小鼠腹腔内注射恩度和榄香烯，观察两药联合对小鼠体重的影响以及血液学和肝肾毒性。(2)腹腔内接种H22腹水瘤细胞建立小鼠恶性腹水模型，分别用4mg/kg、8mg/kg和16mg/kg剂量的恩度以及50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg剂量的榄香烯每天一次连续腹腔注射8天，观察小鼠的平均腹水量和生存期，计算腹水抑制率，确定最佳单药剂量。(3)分别采用两药不同剂量的组合治疗荷瘤小鼠，观察小鼠的平均腹水量和生存期，计算腹水抑制率，确定最佳剂量组合。(4)用已确定的最佳剂量组合单独或联合治疗荷瘤小鼠，分为4组，即对照组、恩度组、榄香烯组和两药联合组，再一次观察疗效，并进一步探讨两药作用的机制:①计量各组小鼠的平均腹水量，根据药物相互作用指数(CDI)判断是否具有协同作用;②计数腹水中肿瘤细胞数和红细胞数;③检测小鼠腹水和血清中蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)的水平;④观察各组小鼠的生存期并绘制生存曲线;⑤透射电镜观察联合组小鼠腹水中肿瘤细胞的亚细胞结构;⑥流式细胞仪检测小鼠循环血内皮细胞的变化;⑦腹膜渗透性检测:从荷瘤小鼠尾静脉注射0.2ml5％的伊文蓝溶液，2h后处死荷瘤小鼠收集腹水并检测其在540nm波长处伊文蓝的吸光度，通过吸光度值间接反映伊文蓝的浓度，从而分析荷瘤小鼠腹膜微血管渗透性;⑧ELISA法检测各组荷瘤小鼠腹水中VEGF、MMP-2、CD44v6和HIF-1α的水平;⑨蛋白免疫印迹杂交技术(WesternBlot)检测各组荷瘤小鼠腹水中肿瘤细胞VEGF、MMP-2、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表达;⑩实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组荷瘤小鼠水中肿瘤细胞VEGFmRNA的表达。
　　 2.体外实验:(1)CCK-8法测定不同浓度的恩度联合不同浓度的榄香烯处理24h和48h后对H22细胞增殖的影响。(2)ELISA法检测恩度、榄香烯单药以及两药联合处理48h后H22细胞上清液中VEGF、CD44V6、MMP-2和HIF-1α的水平。(3)WesternBlot检测恩度、榄香烯单药以及两药联合处理48h后H22细胞巾VEGF和MMP-2蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1.体内实验:(1)恩度联合榄香烯在正常小鼠腹腔内连续腹腔注射8天后对小鼠的体重没有明显影响，也没有观察到血液学毒性以及肝肾毒性。(2)恩度最佳单药剂量为8mg/kg，榄香烯最佳单药剂量为100mg/kg。(3)联合应用时，最佳剂量组合为恩度8mg/kg联合榄香烯100mg/kg。(4)模型组小鼠随机分为4组:对照组（生理盐水）、恩度组（8mg/kg）、榄香烯组(100mg/kg)和两药联合组（恩度8mg/kg联合榄香烯100mg/kg），每天一次连续腹腔内注射8天后处死小鼠，行相关检测:①对照组、恩度组、榄香烯组和联合组小鼠腹水量分别为8.93±0.79、7.34±0.76、4.79±0.47和3.12±0.23ml，计算得CDI值为0.79，两药联合具有协同作用;②实验组均能抑制腹水中的肿瘤细胞数，尤其以联合组效果最佳；榄香烯对腹水中红细胞无明显影响，恩度和联合组均能减少小鼠腹水中的红细胞，但是这两组之间差别没有统计学意义；③恩度和榄香烯均可以降低腹水中蛋白和LDH的含量，联合组效果更明显；各实验组血清中蛋白和LDH水平无明显差异；④对照组、恩度组、榄香烯组和联合组小鼠中位生存期分别为11、14、15和18天，各实验组生存时间延长率分别为34.74%、43.67%和66.67%;⑤透射电镜观察联合组腹水瘤细胞有明显的凋亡，细胞坏死严重；⑥对照组、恩度组、榄香烯组和联合组小鼠循环血中活的内皮细胞占外周有核细胞的百分比(%)分别为6.82±0.91、1.95±0.17、6.16±0.42和0.57±0.09;⑦对照组、恩度组、榄香烯组和联合组小鼠腹水光吸收值（OD值）分别为1.71±0.13、1.45±0.09、1.05±0.08和0.88±0.07;⑧ELISA检测显示联合组较恩度和榄香烯单药进一步下调了小鼠腹水中VEGF、CD44V6、MMP-2和HIF-1α等细胞因子的水平;⑨联合组增强了恩度和榄香烯单药对小鼠腹水瘤细胞中VEGF和MMP-2的抑制；虽然榄香烯对p38MAPK信号通路没有明显影响，但是它增强了恩度对p38MAPK蛋白磷酸化的抑制作用；⑩对照组、恩度组、榄香烯组和联合组VEGFmRNA的相对表达量分别为2.28±0.28，0.94±0.11，1.58±0.15和0.63±0.06。
　　 2.体外实验:(1)恩度对体外培养的H22细胞抑制率在4～8%左右，有剂量依赖性，没有时间依赖性；榄香烯对H22细胞的抑制率在10～40%左右，且具有时间、剂量依赖性；恩度不能增强榄香烯对H22细胞增殖的抑制作用。(2)恩度和榄香烯均能下调H22细胞上清液中VEGF、CD44V6、MMP-2和HIF-1α的水平，两者联合后可增强该作用。(3)恩度和榄香烯可抑制H22细胞中VEGF和MMP-2蛋白的表达，两者联合能进一步增强该作用。
　　 结论：
　　 体内实验证明，8mg/kg剂量恩度联合100mg/kg剂量榄香烯可以协同抑制荷H22腹水瘤小鼠恶性腹水的产生，并能延长荷瘤小鼠生存期。两者联合协同增效的可能机制是:(1)恩度增强了榄香烯对腹水瘤细胞的直接抑制杀伤作用；(2)两药联合有效降低循环血中活的内皮细胞占外周有核细胞的百分比；(3)两药联合从蛋白水平和基因水平进一步抑制了VEGF的表达，从而降低小鼠腹膜微血管的渗透性，并减少蛋白、红细胞等从外周血中渗透入腹膜腔；(4)抑制腹水中CD44V6、MMP-2和HIF-1α等细胞因子的水平，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭和转移;(5)同时具有对肿瘤细胞的抑制杀伤协同作用和抑制肿瘤血管生成的协同作用，两种作用相辅相成，互相补充。
　　 本研究首次证明腹腔内注射恩度和榄香烯治疗恶性腹水具有协同增效作用，为指导临床上联合应用恩度和榄香烯治疗恶性腹水以及进一步开展多中心的临床研究提供了充分的实验依据和理论基础。此外，本研究对于将现代中药制剂联合分子靶向药物治疗恶性肿瘤，具有重要的启迪意义。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 H22细胞的稳定培养和鉴定

第二部分 恩度联合榄香烯小鼠腹腔内注射的安全性评估

第三部分 恩度与榄香烯单药对荷H22腹水瘤小鼠的作用

第四部分 恩度联合榄香烯对荷H22腹水瘤小鼠的作用

第五部分 恩度联合榄香烯抑制小鼠腹水生长的机制研究

第六部分 恩度联合榄香烯对H22细胞增殖及相关细胞因子表达的影响

第七部分 讨论

综述

附录

攻读博士学位期间取得的学术成果

致谢

作者简介