舒乐洗剂质量标准及治疗VVC效应机制初步研究

摘要

外阴阴道念珠菌病(Vulvovaginal Candidiasis，VVC)是念珠菌侵犯外阴和（或）阴道黏膜浅表上皮细胞所导致的炎症。中医学将其归属于“阴痒”、“带下”的范畴，认为本病病机复杂，多因脏腑功能失调、湿热虫毒侵蚀所致。作为妇科常见的真菌感染性疾病，VVC的典型临床表现为外阴瘙痒及阴道分泌物增多，呈白色豆渣样或凝乳样，常伴有阴道灼痛、尿频、尿痛、性交疼痛等不适症状，令患者坐卧不安，痛苦异常。近年来，VVC的发病率和复发率呈不断上升趋势。
　　目前，西医治疗VVC多采用咪唑类广谱抗真菌药物，该法能够直接杀灭念珠菌，对急性VVC的治愈率高，能快速缓解患者不适症状，但易引起阴道内正常菌群失调，一些对药物不敏感的菌群乘机大量繁殖，产生致病性，诱发二重感染，使治疗效果不理想;且广谱抗真菌药毒副作用大，可引发耳毒性、肾毒性、胃肠道反应等不良反应，妊娠期妇女局部用药还可能有致畸作用。
　　近年来，中医药在治疗VVC方面取得了很大进展，从我国丰富的中药资源中发掘出许多具有抗真菌功效的中药及单体均能抑制念珠菌生长，可用于VVC的治疗。长期临床实践中医者开发了不少治疗VVC的中药经验方，并在此基础上研发出许多中药外用制剂，如我院的舒乐洗剂。与广谱抗真菌药物相比，中药治疗VVC具有疗效显著，毒副作用小，无明显耐药性，临床应用广泛等优点，显示出良好的开发前景。
　　舒乐洗剂是徐州市中医院的自制制剂，具有清热燥湿解毒，祛风杀虫止痒的功效，临床应用十余年，治疗VVC等妇科阴道炎症疗效显著。本制剂在申报过程中，按照国家食品药品监督管理局《医疗机构制剂注册管理办法》中医疗机构制剂注册申报资料的要求，对处方组成、制备工艺、性状、鉴别、检查、稳定性、抗炎止痒药理作用、临床疗效等方面进行了相关研究，取得了医疗机构制剂批准文号（苏药制字Z04001627）。为提高制剂质量，确保其安全、有效、可控的用于临床，同时探究其治疗VVC作用机制，本课题在前期已有研究基础上进一步修订舒乐洗剂质量标准草案，增加薄层色谱鉴别和有效成分含量测定项;对舒乐洗剂药效学及临床应用安全性进行实验研究;对舒乐洗剂治疗VVC作用机制进行初步探讨。
　　舒乐洗剂质量标准研究，以对照品、对照药材及相应的阴性制剂为对照，对制剂中苦参、黄柏、白鲜皮、蛇床子、土荆皮等药材进行薄层鉴别，展开斑点清晰，分离效果较好，所选方法专属性强;采用HPLC梯度洗脱法，同时测定制剂中的有效成分苦参碱和盐酸小檗碱，两种成分分离较好，均有良好的线性关系，线性范围:苦参碱为0.4305μg～8.6100μg(r=1.0000)、盐酸小檗碱为0.00585μg～0.1171μg(r=0.9999)，测得回收率分别为98.7％，98.8％，RSD分别为2.81％，2.96％，符合规定要求。初步稳定性研究结果表明:本品在常温留样6个月和加速留样6个月的试验考察期内质量稳定。
　　舒乐洗剂药效学及安全性初步实验研究，通过构建VVC小鼠模型，采用阴道涂片检查和病理组织检测法，比较给药前后炎症状况的变化，明确舒乐洗剂治疗VVC的药理作用;观察舒乐洗剂对家兔正常皮肤及损伤皮肤的刺激性，以确定舒乐洗剂局部应用的安全性。结果表明:舒乐洗剂能够明显抑制VVC小鼠阴道内白色念珠菌菌落形成，减少炎性细胞向阴道黏膜的浸润;舒乐洗剂对家兔正常皮肤无刺激性，对损伤皮肤有轻微刺激性，但与蒸馏水组相比无显著性差异。
　　舒乐洗剂治疗VVC作用机制初步研究，采用连续稀释法，观察舒乐洗剂体外抗白色念珠菌菌落形成的作用;建立体外白色念珠菌生物膜模型，采用XTT减低法检测生物膜抑制率;采用RT-PCR技术，检测小鼠阴道分泌物标本中HWP1、SAP的基因表达，以期从分子水平揭示舒乐洗剂治疗VVC的作用机制。结果表明:舒乐洗剂能够抑制体外白色念珠菌菌落的形成，原液稀释一倍效果最为显著;舒乐洗剂对体外白色念珠菌生物膜的形成有明显抑制作用，并成一定的剂量依赖性;经舒乐洗剂治疗的VVC小鼠，阴道内白色念珠菌毒力基因HWP1和侵袭酶SAP2、SAP4、SAP5的表达显著降低。
　　上述研究结果表明:本制剂修订提高的质量标准可控，成品质量稳定;能明显抑制VVC小鼠阴道内白色念珠菌菌落形成，减少炎性细胞向阴道黏膜的浸润;对家兔正常皮肤无明显刺激性，可供临床安全应用;具有体外抗生物膜作用，能够抑制毒力因子HWP1和SAP的基因表达，为舒乐洗剂临床应用的安全有效性提供科学可靠的实验依据。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献研究

第一节 外阴阴道念珠菌病概述

第二节 舒乐洗剂组方特点、项目背景

第三节 舒乐洗剂组方药物研究概况

第四节 相关技术研究进展

第二章 舒乐洗剂质量标准研究

1 制剂原料来源及鉴定

2 三批样品的制备

3 性状

4 鉴别

4．1 仪器与试药

4．2 苦参薄层色谱鉴别

4．3 黄柏薄层色谱鉴别

4．4 白鲜皮薄层色谱鉴别

4．5 土荆皮薄层色谱鉴别

4．6 蛇床子薄层色谱鉴别

4．7 土茯苓薄层色谱鉴别

4．8 百部薄层色谱鉴别

4．9 花椒薄层色谱鉴别

4．10 玉竹薄层色谱鉴别

4．11 防风薄层色谱鉴别

5 检查

5．1 相对密度

5．2 pH值

5．3 装量

5．4 微生物限度

6 苦参碱和盐酸小檗碱的含量测定

6．1 仪器、材料及药品

6．2 色谱条件

6．3 专属性试验

6．4 标准曲线及线性范围

6．5 精密度试验

6．6 供试品溶液提取制备条件的考察

6．7 稳定性试验

6．8 重复性试验

6．9 准确度试验

6．10 样品含量测定

7 舒乐洗剂质量标准(草案)

8 舒乐洗剂初步稳定性考察

8．1 常温留样考察试验

8．2 加速留样考察试验

9 小结与讨论

9．1 制剂原料研究小结

9．2 制剂鉴别研究小结

9．3 制剂检查研究小结

9．4 制剂中苦参碱和盐酸小檗碱含量测定小结

9．5 制剂初步稳定性考察小结

9．6 关于制剂原料的来源及品质

9．7 关于含量测定中流动相及检测波长的选择

第三章 舒乐洗剂对VVC模型小鼠的抗真菌实验研究

1 实验材料

1．1 实验菌株

1．2 实验动物

1．3 实验试剂

1．4 实验仪器

2 实验方法

2．1 造模及分组

2．2 取材与镜检

2．3 阴道组织病理学检查

3 结果

3．1 舒乐洗剂对小鼠阴道内白色念珠菌生长情况的影响

3．2 舒乐洗剂对小鼠阴道病理组织的影响

4 小结与讨论

第四章 舒乐洗剂皮肤刺激性试验研究

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

2 实验方法

2．1 造模及给药

2．2 刺激强度评价

3 结果

3．1 正常皮肤刺激性试验

3．2 破损皮肤刺激性试验

4 小结与讨论

第五章 舒乐洗剂治疗VVC的作用机制研究

第一节 舒乐洗剂体外抗真菌实验研究

1 实验材料

2 主要培养基／液的配制

3 实验方法

4 结果

5 小结与讨论

第二节 舒乐洗剂影响白色念珠菌毒力基因表达的实验研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结与讨论

第六章 论文总结、特色与创新

1 论文总结

1．1 舒乐洗剂质量标准研究

1．2 舒乐洗剂药效学及皮肤刺激性实验研究

1．3 舒乐洗剂治疗VVC作用机制研究

2 特色与创新

2．1 组方、疗效有特色

2．2 提高医院制剂质量标准

2．3 采用最新研究技术

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢