组分配伍与药剂学技术应用对蛇床子素生物有效性的影响及其机制研究

摘要

蛇床子素是中药蛇床子中一种香豆素类活性化合物，具有解痉、降血压、抗心律失常、增强免疫功能、抗癌、抗骨质疏松、抗炎、抗凋亡、抗过敏等多种药理活性。最新研究发现，蛇床子素对大鼠酒精性脂肪肝的治疗具有较好的疗效。蛇床子素属生物药剂学分类系统中Ⅱ类药物，其疏水性较强，水中溶解度低，导致其低溶出率和较低的体内生物利用度，从而限制了其临床应用。本课题提出不仅药剂学技术应用可改善和提高药物生物利用度，合理的组方配伍也能改善药物的溶解度从而提高生物利用度。组分配伍的合理性表现在协同增效、配伍减毒或减毒增效上，而且也可能表现在药代动力学特征及体内过程中。
　　药剂学技术常被用于改善难溶性药物的溶解度，基于蛇床子素物理化学及生物药剂学特征的研究，迄今为止，有关提高蛇床子素溶出度与生物利用度的研究较少，主要集中于环糊精包合技术、乳化技术、脂质体制备技术、传统的固体分散技术、非离子囊泡技术以及其他半合成结构改造方法等。目前，仅有环糊精包合技术，以体外和体内相结合的方法较系统地研究了增加蛇床子素溶解度从而改善其体内生物利用度的报道。本课题选择新型固体分散介质，应用热熔挤出技术制备蛇床子素固体分散体。与传统固体分散体制备方法相比，热熔挤出可连续操作，操作过程没有有机溶剂，无需干燥，有利于大工业生产。热熔挤出过程中强力的搅拌和搅动阻止了药物的聚集，有利于药物以较小的粒子均匀分散于载体中。本课题采用体外物化表征和体内生物利用度研究，选择合适的辅料改善蛇床子素溶解度，从而提高其体内生物利用度
　　合理的组方配伍也能改善药物的药效并提高生物利用度。组分配伍的合理性主要体现在药理学和生物药剂学环节—主要活性成分生物利用度的相互影响以及吸收、分布、代谢、排泄环节的相互影响。甘草酸是中药甘草的主要活性成分，结构为脂溶性的三萜苷元连接水溶性的2个葡萄糖醛酸，与环糊精很相似。文献研究表明，甘草酸可以与很多疏水性化合物形成复合物，类似于环糊精把疏水性化合物包合在空腔中，从而增加溶解度;其次，甘草酸具有抗炎和肝保护作用，合用可能提高蛇床子素溶解度的同时，在药理学可能表现出协同作用，在吸收、分布、代谢、排泄环节可能存在相互作用。药效学实验研究表明，甘草酸和蛇床子素配伍用药后，肝组织病理切片结果显示配伍后能显著改善蛇床子素治疗酒精性脂肪肝疗效，对酒精和高脂饲料诱导的大鼠脂肪肝具有更好的防治作用。药代动力学实验表明，甘草酸配伍后能提高蛇床子素体内生物利用度。因此，本课题选用甘草酸与蛇床子素配伍，从药理学角度和生物药剂学角度阐明二者配伍的合理性。
　　蛇床子素的基本性质进行了研究结果表明，蛇床子素在正辛醇-水中的表观油水分配系数P为6562.19(logP=3.82)，说明其疏水性很强。不同pH范围内的表观油水分配系数研究结果表明，其P值受溶液的pH值影响不大，提示其在整个胃肠道均有较好的吸收。采用药代动力学模型，建立了快速、简便、准确的LC-MS/MS联用技术测定大鼠口服和静注蛇床子素后血浆中蛇床子素的浓度，该技术重现性好，操作简便、结果准确。大鼠药代动力学研究结果表明，蛇床子素绝对生物利用度仅为15.65％。
　　采用热熔挤出技术制备蛇床子素固体分散体，通过药物溶解度参计算，初步筛选出Plasdone S-630、HPMC-E5、Eudragit EPO和Soluplus这4种新型辅料，用于热熔挤出制备固体分散体。差示量热分析、X-射线衍射分析和红外光谱用于表征固体分散体的形成，结合体外溶出度为指标，评价各载体固体分散体溶出行为。最终选择Plasdone S-630、HPMC和Eudragit EPO进行大鼠体内生物利用度评价，进一步验证载体材料筛选的合理性。结果表明，与蛇床子素单体相比，仅Plasdone S-630和HPMC制得的固体分散体能显著提高蛇床子素大鼠体内Cmax（～5倍）和AUC（～1.4倍），显著降低Tmax，而Eudragit EPO并不能改善蛇床子素体内生物利用度。蛇床子素适宜的固体分散体分散介质为Plasdone S-630和HPMC。
　　组分（成分）配伍的合理不仅可以表达在药效作用机制上，同样可表达在生物药剂学与药代动力学过程中。
　　采用治疗性给药方案，即酒精性脂肪肝模型成功造模后，继续造模的同时给予药物治疗，进行了两者配伍的药效学初探，考察了甘草酸与蛇床子素配伍对酒精性脂肪肝模型的防治作用的最佳比例，结合各项指标综合分析，结果选用的最佳比例为蛇床子素中剂量+甘草酸中剂量(1∶2.25)，给药周期为4周。在此基础上，我们对该比例再次进行了酒精性脂肪肝模型造模药效学验证实验，综合各指标分析评价，显示蛇床子素中剂量+甘草酸中剂量(1∶2.25)仍为最优，从而对比例筛选实验结果有了较好的验证。
　　通过大鼠灌胃给药提取肝组织样本，采用Western blotting技术检测肝组织脂肪分解通路三种关键蛋白（PPARα、CPT-1、RXRα蛋白)的表达量，进一步验证前期筛选所得甘草酸与蛇床子素配伍最佳比例的合理性，结果显示与前期整体动物试验结果一致，表明甘草酸配伍可以增强治疗酒精性脂肪肝效果，进一步从分子水平验证前期所筛选的蛇床子素中剂量+甘草酸中剂量(1∶2.25)比例的合理性。
　　在药理学角度探讨了二者配伍增效的机制基础上，进一步从生物药剂学角度探讨了二者配伍的科学内涵。采用大鼠药代动力学模型比较分析了甘草酸与蛇床子素配伍前后，蛇床子素在大鼠体内药代动力学特征的变化。结果表明，配伍后Cmax和AUC0-24h显著提高(P＜0.05)，提示甘草酸能显著提高蛇床子素大鼠体内生物利用度。本课题采用多种模型研究甘草酸及其体内主要水解产物甘草次酸对蛇床子素体外增溶、及对其吸收、分布、代谢、排泄的影响，阐明甘草酸提高蛇床子素生物利用度的原因。最后，采用大鼠药代动力学模型研究了甘草酸体内水解产物甘草次酸对蛇床子素体内生物利用度的影响，进一步与上述结果互为补充，确证配伍后蛇床子素体内生物利用度的提高的主要原因。
　　体外溶解度实验研究甘草酸及其水解产物甘草次酸对蛇床子素溶解度的影响，结果表明，甘草酸对蛇床子素有显著增溶作用，且增溶效应与甘草酸浓度成正比，而甘草次酸则不影响蛇床子素溶解度。甘草酸增溶的作用主要与甘草酸的结构有关，其结构与环糊精相似。在低溶解度时，有利于形成包含疏水空腔的环状二聚物的结构，这种空腔的存在有利于主客体包合物的形成，与环糊精相似。此外，甘草酸结构中有疏水部分（三萜烯部分）和亲水部分（两个葡萄糖醛酸），提示甘草酸可能在水溶液中形成胶束，从而增溶。推测甘草酸通过提高蛇床子素溶解度，是蛇床子素体内生物利用度提高的一个原因。
　　采用X-衍射分析和红外光谱分析探讨甘草酸对蛇床子素的增溶机制，X-衍射分析结果表明，蛇床子素在甘草酸中是以无定型状态存在;红外光谱结果显示，甘草酸与蛇床子素之间可能形成氢键，二者间存在相互作用。因此，甘草酸增加蛇床子素溶解度的原因可能为蛇床子素在甘草酸中由晶型转变为无定型形式存在，更易于蛇床子素溶解，同时二者间具有氢键作用，从而使得蛇床子素溶解度提高。
　　采用Caco-2模型，研究了蛇床子素在体外的吸收转运过程，以及甘草酸及其体内水解产物甘草次酸对蛇床子素在Caco-2细胞吸收的影响，结果表明，蛇床子素吸收较好，甘草酸不能促进蛇床子素A测到B测的吸收，同时，甘草酸在体内的水解产物甘草次酸亦不能促进其吸收。甘草酸提高蛇床子素体内生物利用度的原因可能并不是通过甘草酸和甘草次酸的促吸收作用。
　　采用大鼠体内组织分布模型考察了蛇床子素在大鼠体内分布的状况以及甘草酸合用蛇床子素后，药效显著增强是否与甘草酸影响蛇床子素体内分布有关。实验结果表明，口服蛇床子素单体和蛇床子素+甘草酸配伍给药后，于胃肠分布最高，经胃肠吸收后，迅速分布到不同组织器官中，然后于不同组织器官中快速消除。两组中各组织的分布总体趋势表明，蛇床子素主要分布在肝、脾、肾等血流量丰富的组织。在这三者中，尤以肝脏中最高，提示这与药效学方面蛇床子素具有保肝、调节肝脏脂代谢、治疗酒精性脂肪肝等作用密切相关。其次为脾、肾组织中较高，这与中医上蛇床子入肾、脾经相吻合，同时可能与蛇床子温肾助阳、祛风燥湿、增强免疫功能等作用相关。通过对各时间点蛇床子素在单体组和配伍组中相应脏器中分布情况的比较，结果显示，甘草酸影响了蛇床子素在体内部分组织的分布。甘草酸提高了蛇床子素血液中浓度，推测可能提高其体内生物利用度从而增强药效;甘草酸对蛇床子素在脾、肾、胃等组织分布无显著性影响，对心、小肠组织不同时间点影响不同，甘草酸能增加蛇床子素在肝、肺组织中的分布，提示甘草酸增强蛇床子素治疗酒精性脂肪肝的效果可能与甘草酸能显著提高蛇床子素在肝组织中的分布，使其在肝组织中富集密切相关。
　　采用大鼠肠S9和肝S9Ⅰ相孵育系统研究了蛇床子素体外代谢的情况，以及甘草酸配伍蛇床子素对蛇床子素体外代谢的影响，从而考察配伍后蛇床子素生物利用度的升高是否存在代谢环节的相互作用。结果表明，肠S9和肝S9Ⅰ相孵育体系中加入甘草酸和甘草次酸均不减缓蛇床子素代谢，从而说明，甘草酸提高蛇床子素体内生物利用度的原因可能并非减缓其代谢。
　　采用大鼠体内排泄研究了大鼠口服蛇床子素后经粪便、尿液排泄情况，以及甘草酸配伍后对蛇床子素体内排泄的影响。结果表明，蛇床子素单体组24h内尿液中累计排泄量为0.01％，粪便中累计排泄量为0.25％，说明蛇床子素以原型排泄量都不到1％，推测蛇床子素可能主要以代谢产物形式排泄，在体内被广泛代谢。蛇床子素+甘草酸配伍组中24h内蛇床子素尿液累积排泄量占给药量的0.08％，粪便累积排泄量占给药量的0.96％。虽然甘草酸使蛇床子素尿液中排泄增多，但由于蛇床子素在体内经尿和粪便排泄不到1％，所以甘草酸对其排泄的影响几乎可以忽略不计。
　　最后采用大鼠药代动力学模型，研究了甘草酸体内水解产物甘草次酸对蛇床子素体内生物利用度的影响，结果表明甘草次酸不能显著提高蛇床子素的体内生物利用度，揭示甘草酸显著提高蛇床子素生物利用度主要通过甘草酸本身，而非通过其体内水解产物甘草次酸发挥作用，与机制探讨结果相吻合。该结果从体内进一步验证了甘草酸提高蛇床子素体内生物利用度作用主要通过甘草酸提高了蛇床子素的溶解度，从而提高其体内生物利用度。
　　本课题采用热熔挤出技术，通过辅料筛选，制备蛇床子素固体分散体，从而增加蛇床子素的溶解度，大鼠药代动力学发现该固体分散体可以提高蛇床子素生物利用度。采用甘草酸配伍改善蛇床子素的溶解度，提高其生物利用度，并从药理学角度和生物药剂学角度阐明二者配伍的合理性。结果表明，二者配伍药效增强，对酒精性脂肪肝的治疗具有协同作用;通过甘草酸提高蛇床子素的生物利用度机制探讨，发现主要原因为甘草酸的增溶作用。在选择应用药剂学技术改善难溶性药物生物利用度的同时，关注组分配伍对药物体内过程的影响，探讨组分配伍的合理内涵，对进一步开展剂型设计和生物有效性评价具有极其重要的意义。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

第一章 蛇床子素体内过程及其组分配伍和药剂学技术应用影响研究

参考文献

第二章 酒精性脂肪肝形成机制及蛇床子素和甘草酸配伍优势研究

参考文献

第二部分 实验部分

第一章 蛇床子素的基本性质及药代动力学研究

第一节 蛇床子素平衡溶解度和表观油水分配系数的测定

第二节 蛇床子素大鼠体内药代动力学研究

第三节 本章小结

参考文献

第二章 热熔挤出制备蛇床子素固体分散体

第一节 热熔挤出制备蛇床子素固体分散体

第二节 蛇床子素固体分散体大鼠体内生物利用度研究

第三节 本章小结

参考文献

第三章 甘草酸与蛇床子素配伍药效学研究及初步机制探讨

第一节 蛇床子素与甘草配伍比例筛选实验

第二节 甘草酸和蛇床子素配伍比例验证

第三节 甘草酸配伍蛇床子素对肝脏脂肪分解通路关键蛋白表达的影响研究

第四节 本章小结

参考文献

第四章 甘草酸对蛇床子素口服生物利用度的影响研究及机制探讨

第一节 甘草酸对蛇床子素体内药代动力学特征的影响研究

第二节 甘草酸和甘草次酸对蛇床子素体外溶解度的影响

第三节 甘草酸对蛇床子素增溶机制探讨

第四节 Caco-2细胞模型的建立与验证

第五节 MTT法测定蛇床子素的细胞毒性

第六节 甘草酸及甘草次酸对蛇床子素体外吸收特性评价

第七节 甘草酸对蛇床子素大鼠体内分布的影响研究

第八节 甘草酸、甘草次酸对蛇床子素在大鼠肠S9代谢的影响研究

第九节 甘草酸、甘草次酸对蛇床子素在大鼠肝S9代谢的影响研究

第十节 甘草酸对蛇床子素大鼠体内排泄的影响研究

第十一节 甘草次酸对蛇床子素体内药动学影响研究

第十二节 本章小结

参考文献

第三部分 论文总结与展望

一、总结与展望

二、论文创新点

攻读博士学位期间取得的学术成果

致谢