基于生物网络调控下丹参抗肿瘤血管生成研究——隐丹参酮诱导血管内皮细胞凋亡的机制研究

摘要

肿瘤血管生成是肿瘤生长与转移的重要过程。作为血管生成的基础单元，血管内皮细胞在多种促血管生成因子的作用下，会不断增殖，促使肿瘤血管网络的不断扩张。目前，多种治疗策略就是靶向血管内皮细胞，抑制血管内皮细胞在肿瘤血管生成过程中发挥作用。隐丹参酮是丹参脂溶性醌类化合物之一。前期有关隐丹参酮抗肿瘤的整体实验发现，隐丹参酮具有显著的抑制肿瘤血管生成的能力。此实验结果已经被多个课题组所证实。然而，隐丹参酮的抗肿瘤血管的作用机制鲜有报道。鉴于此，本课题选择隐丹参酮来研究其对血管内皮细胞的作用及其具体的作用机制。
　　本研究首先是采用血管内皮细胞的管腔形成实验、大鼠动脉环的血管生成实验和B16F10荷瘤小鼠的瘤内血管生成实验，从细胞、离体和整体动物三方面来考查隐丹参酮对肿瘤血管生成的影响。以隐丹参酮(Cryptotanshinone)为检索词，通过Cytoscape软件筛选到隐丹参酮调控血管生成的可能靶点或通路，即主要与诱导胞内ROS超载的凋亡、抑制MAPK信号通路及Bcl-2蛋白家族等有关。采用MTT法、流式细胞仪、Western blot考查隐丹参酮对血管内皮细胞的作用，结果表明隐丹参酮能剂量依赖性和时间依赖性地抑制血管内皮细胞的增殖，且主要与其诱导血管内皮细胞的凋亡有关。进一步的研究发现隐丹参酮诱导血管内皮细胞凋亡主要与其促进线粒体中细胞色素C的释放，激活内源性线粒体凋亡信号通路有关。检测不同时间点隐丹参酮对细胞色素C释放的影响，发现隐丹参酮作用6h后，就能在胞浆中检测到细胞色素C。使用线粒体膜通透性转运孔的特异性抑制剂—环孢菌素A，发现在同样时间点即6h时，仍能检测到细胞色素C的释放。表明隐丹参酮作用6h时引起的细胞色素C的释放并不是由线粒体膜通透性转运孔开放引起的;通过检测线粒体外膜机械性损伤相关指标Ca2+浓度和ROS的水平发现，隐丹参酮作用6h时并不会引起细胞中Ca2+浓度和ROS水平的超载和线粒体的超微结构的损伤，即进一步排除了隐丹参酮通过引发线粒体外膜机械性损伤诱导细胞色素C的释放;Western blot检测发现，隐丹参酮作用6h时能显著抑制Bcl-2和Bcl-xl的表达，升高Bax和BimEL的表达。其中，BimEL的变化最为明显;采用siRNA沉默Bim表达发现，隐丹参酮诱导细胞色素C的释放受到了一定程度的影响;Bim的沉默并不影响血管内皮细胞的增殖活性和管腔形成能力，初步表明隐丹参酮作用6h引起的细胞色素C的释放与线粒体外膜上特异性通道的形成有关，且主要与促凋亡蛋白Bim有关。进一步研究发现，隐丹参酮能促进血管内皮细胞中BimEL与Bax蛋白相互结合形成复合物，再同线粒体外膜VDAC结合，进而来调控细胞色素C的释放。
　　以上结果表明，隐丹参酮促进血管内皮细胞中BimEL与Bax蛋白相互结合形成复合物，再同线粒体外膜VDAC结合，调控线粒体中细胞色素C释放到胞浆，进而激活内源性线粒体凋亡信号通路，最终诱导血管内皮细胞的凋亡，发挥抗肿瘤血管生成作用。
　　在正常成年人的血管中，绝大部分血管内皮细胞都处于静息期。那么，隐丹参酮是否对静息期的血管内皮细胞有作用？为排除这一情况，我们通过构建静息期的血管内皮细胞模型来考察隐丹参酮对其的影响，结果发现隐丹参酮对其不敏感。这个结果说明了隐丹参酮不损伤正常血管中的内皮细胞。

目录

声明

摘要

第一部分 前言

1．肿瘤血管生成是肿瘤发生发展的重要过程

2．血管内皮细胞是抗肿瘤血管生成的重要靶细胞

3．基于中药活性成分的“多靶点”，隐丹参酮抑制肿瘤血管生成是其抗肿瘤的潜在作用方式

4．课题假说的提出

5．课题意义

第二部分 隐丹参酮抑制肿瘤血管生成的实验验证

1．隐丹参酮抗VEGF诱导HUVEC的管腔形成的作用

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 实验小结

2．隐丹参酮抗VEGF诱导大鼠动脉环的血管芽生的作用

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 实验小结

3．隐丹参酮抗B16F10荷瘤小鼠的瘤内血管生成的作用

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 实验小结

4．实验总结

第三部分 隐丹参酮靶向血管生成的调控网络

1．隐丹参酮调控的生物网络及其关键节点

1．1 实验软件与方法

1．2 实验过程与结果

1．3 实验小结

2．隐丹参酮调控血管生成网络的节点预测

2．1 实验软件与方法

2．2 实验过程与结果

2．3 实验小结

3．实验总结

第四部分 隐丹参酮诱导血管内皮细胞凋亡及其机制研究

1．隐丹参酮诱导血管内皮细胞凋亡

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 实验小结

2．隐丹参酮对血管内皮细胞细胞色素C释放的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 实验小结

3．隐丹参酮对血管内皮细胞内源性线粒体凋亡信号通路的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 实验小结

4．隐丹参酮激活内源性线粒体凋亡信号通路的验证

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 实验小结

5．实验总结

第五部分 隐丹参酮诱导细胞色素C的释放及其机制研究

1．隐丹参酮对血管内皮细胞的细胞色素C释放的时效影响

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 实验小结

2．隐丹参酮对线粒体跨膜通透性转运孔的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 实验小结

3．隐丹参酮对线粒体外膜机械性损伤的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 实验小结

4．隐丹参酮对线粒体外膜上特异性通道形成的影响

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结采

4．4 实验小结

5．实验总结

第六部分 隐丹参酮对静息态内皮细胞的不敏感性

1．静息态内皮细胞模型的构建与验证

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 实验小结

2．隐丹参酮对静息态血管内皮细胞的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 实验小结

3．实验总结

总结与展望

1．总结

2．论文的创新点

3．研究的不足和展望

参考文献

综述 以线粒体为靶标的抗肿瘤血管生成药物的研究进展

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢