多重药效结合数理模式的漏芦抗肺癌物质基础研究

摘要

漏芦为菊科漏芦属植物祁州漏芦Rhaponticum uniflorum(L.)DC.的干燥根，具有清热、解毒、消痈、除肿等功效。漏芦有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、直接杀伤肿瘤细胞、阻滞肿瘤细胞周期、逆转多药耐药性、提高机体免疫力等方面的抗肿瘤作用。漏芦临床抗肿瘤疗效确切，但是抗肿瘤的物质基础尚未明确，本研究以多重药效结合数理模式的方法为漏芦抗肺癌物质基础研究提供思路。
　　本研究以生物活性为导向，采用液液萃取、大孔吸附树脂、高效液相色谱等方法分离纯化漏芦抗肺癌的活性部位;建立人肺腺癌细胞A549、H1299模型和鼠源性肺癌细胞Lewis接种C57 BL/6J小鼠模型，筛选漏芦抗肺癌的活性部位。结果表明，漏芦萃取部位均有抑制A549、H1299增殖的作用，正丁醇部位优于其他部位，抑制增殖的IC50分别为生药浓度205.43±16.10μg·mL-1和315.87±13.72μg·mL-1;漏芦大孔吸附树脂乙醇洗脱部位均有抑制A549、H1299增殖的作用，50％部位优于其他部位，抑制增殖的IC50分别为生药浓度163.09±13.22μg·mL-1和287.34±15.04μg·mL-1。漏芦正丁醇部位能显著抑制Lewis荷瘤小鼠肿瘤的生长，正丁醇高低剂量组抑瘤率分别为37.43±4.80％和32.91±7.31％。
　　本研究采用UPLC/Q-TOF-MS-MS和HPLC对漏芦活性部位进行分析，漏芦活性部位的主要成分是三萜类、甾醇类和酚酸类。针对不同批次、产地的漏芦，运用主成分分析、聚类分析，初步发现漏芦抗肺癌的活性组分是以齐墩果酸和熊果酸为代表的三萜类，以β-谷甾醇和豆甾醇为代表的甾醇类，以迷迭香酸和咖啡酸为代表的酚酸类。在此基础上，利用基线等比结合均匀设计的数理统计方法对漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比进行优化设计，得出12个组别。
　　本研究建立肺癌细胞A549体外模型，观察漏芦中组分结构配比对A549的增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响，通过计算回归方程，得出优化组分结构配比，并获得组分贡献度系数;建立人源性肺癌细胞A549接种裸鼠的体内模型，验证优化配比的整体抗肺癌作用。结果表明，漏芦组分结构配比12为优化配比。配比12显著抑制A549增殖，抑制增殖的IC50为143.00±28.31生药μg·mL-1;配比12显著诱导A549凋亡，凋亡率为42.04％;配比12显著抑制肺癌细胞A549侵袭，侵袭的细胞数为87.88±8.36个;配比12显著抑制A549迁移，A549的伤口愈合率为9.56％;优化配比12抑制裸鼠肿瘤生长的抑制率为55.39±0.07％。配比12为河北漏芦组分的配比，道地药材河北漏芦抗肺癌的优效性在于独特的组分结构配比，即齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、迷迭香酸、咖啡酸配比为1.00∶0.75∶0.43∶1.03∶1.46∶0.70。
　　漏芦通过以齐墩果酸和熊果酸为代表的三萜类，β-谷甾醇和豆甾醇为代表的甾醇类，咖啡酸和迷迭香酸为代表的酚酸类等成分协同发挥多组分、多功效的整体抗肺癌作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 以抗肺癌活性为导向的漏芦活性部位体内外筛选

2．1 漏芦活性部位的分离纯化

2．1．1 漏芦萃取部位的分离纯化

2．1．2 漏芦大孔吸附树脂乙醇洗脱部位的分离纯化

2．1．3 本节小结

2．2 漏芦活性部位的体外筛选

2．2．1 体外人肺腺癌细胞A549和H1299筛选模型的建立

2．2．2 漏芦醇提和萃取部位抑制肺癌细胞A549、H1299增殖的影响

2．2．3 漏芦大孔吸附树脂乙醇洗脱部位抑制肺癌细胞A549、H1299增殖的影响

2．3 漏芦活性部位的体内筛选

2．3．1 Lewis细胞接种C57 BL／6J小鼠模型的建立

2．3．2 漏芦萃取部位对荷瘤小鼠肿瘤及脏器指数的影响

2．3．3 本节小结

2．4 本章小结

第三章 漏芦抗肺癌活性部位的解析

3．1 UPLC／Q-TOF-MS-MS对漏芦化学成分的解析

3．1．1 UPLC／Q-TOF-MS-MS对漏芦醇提和萃取部位的解析

3．1．2 本节小结

3．2 漏芦抗肺癌活性部位的HPLC分析

3．2．1 漏芦醇提和萃取部位的HPLC分析

3．2．2 漏芦大孔吸附树脂乙醇洗脱部位的HPLC分析

3．2．3 本节小结

3．3 本章小结

第四章 漏芦抗肺癌组分结构的优化及体内外作用的研究

4．1 河北漏芦抗肺癌组分的研究

4．1．1 7个产地漏芦的聚类分析

4．1．2 7个产地漏芦的主成分分析

4．1．3 本节小结

4．2 漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比的体外抗肺癌作用

4．2．1 7个产地漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类抗肺癌组分的含量测定

4．2．2 基线等比增减设计法结合均匀设计法对漏芦抗肺癌组分的配比研究

4．2．3 漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比抑制肺癌细胞A549增殖的作用

4．2．4 漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比诱导A549凋亡的作用

4．2．5 漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比抑制A549细胞侵袭的作用

4．2．6 漏芦三萜类、甾醇类、酚酸类组分结构配比抑制A549迁移的作用

4．2．7 本节小结

4．3 漏芦优化组分配比的体内抗肺癌作用

4．3．1 A549细胞接种裸鼠模型的建立

4．3．2 漏芦优化配比对裸鼠肿瘤及脏器指数的作用

4．3．3 本节小结

4．4 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢