从线粒体途径研究川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡效应机制

摘要

恶性肿瘤是人类健康面临的重大问题之一。目前放疗、化疗等治疗方法仍然存在副作用大、耐药等问题。因此，寻找防治肿瘤有效药物成为当务之急。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）具有多种药理活性，如抗氧化、改善微循环及抗肿瘤等[1]。近年来，川芎嗪抗肿瘤作用日益受到关注，但围绕川芎嗪诱导肿瘤细胞凋亡机制需进一步探索。线粒体是细胞凋亡过程中起关键作用的细胞器。线粒体途径凋亡(Mitochondrial pathway of apoptosis)主要是线粒体上游信号分子启动后作用于线粒体膜，线粒体膜的功能状态改变引起Bcl-2蛋白家族活化，线粒体PT孔（Permeability transition pore，PT）打开，色素细胞c(Cytochrome c，Cyt-c)启动释放，引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartatespecific proteinase，Caspase)蛋白家族活化，促使细胞凋亡。
　　目的：通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测肿瘤细胞增殖抑制并筛选靶肿瘤细胞株。探讨川芎嗪诱导细胞凋亡量效关系、时效关系以及影响线粒体相关蛋白表达及功能变化。重点研究川芎嗪对HepG2细胞凋亡、线粒体功能及相关蛋白表达的影响，探讨川芎嗪抑制HepG2细胞增殖的分子机制，探索从线粒体途径揭示川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡效应机制。
　　方法：采用CCK-8法观察川芎嗪对HepG2、A549、SMMC-7721、MCF-7、MCF-10A、L-O2、及BEAS-2B细胞增殖抑制作用。通过IC50及靶向作用效果筛选出HepG2细胞，并观察川芎嗪抑制HepG2增殖作用及量效关系。通过实时细胞分析技术观察川芎嗪对HepG2细胞增殖抑制能力的影响。流式细胞技术观察川芎嗪对HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响。通过全自动蛋白系统，观察川芎嗪对HepG2细胞P53蛋白以及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。高内涵系统观察川芎嗪对HepG2细胞Cyt-c的释放以及线粒体跨膜电位的影响;通过全自动蛋白分析系统，观察川芎嗪对HepG2细胞cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9的蛋白表达的影响，以期探讨川芎嗪诱导HepG2凋亡效应机制。
　　结果：1.川芎嗪抑制HepG2细胞增殖。10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL及400μg/mL组抑制率与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，且200μg/mL及400μg/mL组抑制率高于阳性药组。川芎嗪干预HepG2细胞12、24和48h后均能显著抑制HepG2细胞的增殖(P＜0.01)。川芎嗪干预HepG2细胞后能显著降低细胞核大小(P＜0.05)，显著增加AnnexinⅤ-FITC（P＜0.01）和PI(P＜0.01)荧光值。川芎嗪能显著诱导HepG2细胞凋亡，呈量效、时效相关。
　　2.川芎嗪显著影响HepG2细胞周期。100μg/mL川芎嗪干预HepG2细胞12h后，能显著增加HepG2细胞处于G0/G1期的数量(P＜0.01)。100μg/mL川芎嗪干预HepG2细胞24h和48h后，HepG2细胞凋亡数量显著增加(P＜0.01)。
　　3.川芎嗪显著增加Cyt-c转位(P＜0.01);显著降低线粒体膜电位(P＜0.05)。显著增加cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白的表达(P＜0.01)。100μg/mL川芎嗪干预HepG2细胞使得p53蛋白的表达显著上升（P＜0.01）。100μg/mL川芎嗪干预HepG2细胞使得Bcl-2/Bax蛋白表达比率显著下降(P＜0.01)。
　　结论：1.川芎嗪对HepG2、A549、SMMC-7721及MCF-7等肿瘤细胞细胞增殖有抑制作用。
　　2.川芎嗪对HepG2增殖抑制呈剂量依赖性和时间依赖性，IC50剂量低，抑制作用显著。
　　3.川芎嗪干预HepG2细胞12h主要诱导细胞G0/G1期阻滞;作用24h和48h后能够显著诱导HepG2细胞凋亡。
　　4.川芎嗪能够显著增加p53蛋白表达、降低Bcl-2/Bax表达比率，促发线粒体膜电位降低，显著增加Cyt-c转位，从而增加cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表达，表明川芎嗪通过Caspase依赖性线粒体介导的细胞凋亡途径抑制HepG2细胞增殖。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

第一部分 文献综述

一 川芎嗪研究进展

二 川芎嗪抗肿瘤研究进展

三 线粒体途径凋亡机制研究进展

第二部分 川芎嗪抗肿瘤筛选及其诱导HepG2细胞凋亡效应机制研究

一 川芎嗪对肿瘤细胞增殖抑制作用的影响

1 仪器与材料

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

二 川芎嗪对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

1 仪器与材料

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

三 川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡的分子机制

1 仪器与材料

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

结语

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

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