人参皂苷Re促进坐骨神经损伤后周围神经再生的机制研究

摘要

目的：
　　1、基于人参皂苷Re在体内和体外都通过不同的机制来发挥生理学功能的特性，探索能够促进神经再生的有效药物。
　　2、在坐骨神经损伤(SNC)大鼠模型中，评估人参皂苷Re对施万细胞的增殖、分化和迁移的影响。
　　3、探索人参皂苷Re处理的坐骨神经损伤模型中周围神经损伤修复的机制。
　　方法：
　　1、动物模型的建立与取材
　　(1)选用健康成年SD大鼠(180-220g)，雌雄不限。
　　(2)将健康成年SD大鼠放置在动物中心适应性生长14大，食水不限。
　　(3)将大鼠分成Normal组(n=4)，Saline组(n=4)，损伤组，（Re用量分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mg/kg，每组n=4），Normal组不作处理，Sanline组给予同剂量的生理盐水。连续给药三周。
　　(4)在给药的第二周，选取大鼠，应用复合麻醉剂(3ml/kg)施以腹腔注射，使得大鼠麻醉。
　　(5)应用严格灭菌的手术器械于大鼠右侧大腿中间部切开，暴露出坐骨神经，找到距离其分叉0.5cm处。
　　(6)坐骨神经夹伤模型的建立，应用灭菌止血钳夹3次，每次持续10s，三次之间间隔10s。
　　(7)坐骨神经缺损模型的建立，应用灭菌器械分别造成0.2、0.5、1cm的缺损。
　　(8)根据坐骨神经损伤后所设的8个观察时相点随机将大鼠分为8个实验组:0小时（即正常组）、6小时、12小时、1天、3天、5天、1周和2周。每个实验组6只大鼠，其中3只用于免疫印迹，另外3只用于组织切片检测。
　　2、运用足迹分析评估坐骨神经功能指数(SFI)和展趾功能指数(TSI)。
　　3、免疫印迹和免疫荧光检测坐骨神经损伤后周围神经再生的指标变化情况。
　　4、免疫印迹检测人参皂苷Re对p-ERK、p-JNK、p-p38表达变化的影响。
　　5、细胞水平检测人参皂苷Re对施万细胞迁移作用的影响。
　　结果：
　　1、免疫印迹结果显示，坐骨神经损伤后，人参皂苷Re可以以剂量依赖性的方式调节增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。
　　2、电镜组织学分析表明2.0mg/kg人参皂苷Re可以保护坐骨神经，促进髓鞘的再生，保护神经纤维的形状。
　　3、免疫荧光结果表明轴突生长相关蛋白（GAP-43），施万细胞的marker(S-100)，神经元的marker(NF-200)在人参皂苷Re作用下，与坐骨神经损伤对照组相比其表达发生了明显的变化。
　　4、免疫荧光双标结果显示，坐骨神经损伤模型中，人参皂苷Re可以显著增强施万细胞中PCNA的表达。
　　5、免疫印迹以及免疫荧光双标结果表明在坐骨神经损伤模型中，人参皂苷Re可以显著增强施万细胞中八聚体结合转录因子6(Oct-6)的表达，并能促进施万细胞的分化。
　　6、免疫印迹结果表明在提取的原代施万细胞中，人参皂苷Re可以显著增加p-ERK、p-JNK的表达，而对p-p38的表达却没有明显的影响。
　　7、运用trans-well以及划痕实验，我们发现人参皂苷Re处理过的施万细胞的迁移能力显著增强。
　　结论：
　　1、在坐骨神经损伤模型中，人参皂苷Re能显著的促进施万细胞的增殖、分化、迁移能力，从而促进周围神经再生。
　　2、在坐骨神经损伤模型中，人参皂苷Re促进周围神经再生的机制和ERK及JNK通路的活化相关。

目录

声明

摘要

1．绪论

1．1 课题来源、研究的目的和意义

1．2 国内外研究概况

1．2．1 国外研究概况

1．2．2 国内研究概况

1．3 论文的主要研究内容

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．2 实验流程与方法

2．2．1 动物模型的建立与取材

2．2．2 免疫印迹

2．2．3 免疫组织荧光

2．2．4 细胞培养

2．2．5 免疫细胞荧光

2．2．6 相关试剂配制

2．2．7 数据分析与作图

3． 结果

3．1 足迹实验评估坐骨神经功能指数(SFI)和展趾功能指数(TSI)

3．2 SNC模型中施万细胞增殖对人参皂苷Re的剂量依赖性

3．3 电镜检测人参皂苷Re对SNC模型的神经再生的促进作用

3．4 免疫荧光染色检测轴突修复过程中表型特异的marker的变化情况

3．5 SNC模型中免疫荧光双标检测S100和PCNA的共定位情况

3．6 人参皂苷Re处理的SNC模型中Oct6的表达情况

3．7 人参皂苷Re处理的SNC模型中施万细胞的增殖的增强是通过ERK1／2 and JNK1／2依赖的信号通路

4． 讨论

5． 结论

参考文献

附录 人参皂苷的药理作用及研究进展

缩略词表

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介