姜黄素调控长链非编码RNA AK125910诱导肝癌细胞凋亡和抑制侵袭的研究

摘要

片姜黄是许多名老中医防治慢性肝炎、肝硬化和肝癌经验方中的主要药物之一，大量的实验研究表明姜黄、菖蒲、莪术和郁金等中药的提取物——姜黄素，具有抑制癌细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。课题研究发现姜黄素可能通过上调lncRNA AK125910而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为，从而调控肝癌的发生发展。
　　目的:
　　借助lncRNA表达谱芯片，筛选姜黄素对lncRNA的调控作用，进一步深入研究lncRNA AK125910在肝癌发生的调控作用以及姜黄素的干预机制。揭示lncRNAAK125910与肝癌的内在联系，以及姜黄素抑制肝癌细胞的作用与lncRNA AK125910的关系。
　　方法:
　　1.采用lncRNA芯片筛选姜黄素处理肝癌细胞的相关lncRNA，并使用荧光定量PCR和western blot技术进行验证;构建siRNA-AK125910瞬时转染肝癌细胞，下调lncRNAAK125910的表达。采用MTT法检测细胞凋亡，Brdu标记检测细胞增殖，Transewell检测细胞侵袭;
　　2.使用生物信息学技术检测lncRNAAK125910的下游靶基因，并使用荧光定量PCR和western blot技术进行验证;
　　3.在构建siRNA-AK125910瞬时转染肝癌细胞的基础上，检测与肝癌细胞增殖、侵袭相关的蛋白表达情况，对姜黄素调控lncRNAAK125910的分子机制初步探索。
　　结果:
　　1.使用lncRNA表达芯片，证实在姜黄素处理的肝癌细胞中，lncRNA的fold change＞5的lncRNA有7条，其中有5条表达增高，包括AK125910、uc009ycs、HMlincRNA717、chrⅩ:149438637-149438034和chr7:155933475-155996100;而2条表达降低，包括chr1:17129210938-17129213215和AP1879664;其中AK125910的表达上调最明显，为9.78倍。RealtimePCR的结果显示，lncRNAAK125910的表达出现显著上调，为空白对照组的8.92±2.33倍(p＜0.001)，这与芯片结果一致，表明lncRNAAK125910在姜黄素诱导肝癌细胞凋亡中起到了调控作用。
　　2.使用MTT、brdu标记和Transwell法检测了lncRNAAK125910在姜黄素诱导肝癌细胞中的作用研究，证实了lncRNA AK125910参与了姜黄素诱导肝癌细胞凋亡，抑制其增殖和侵袭转移的作用。
　　3.通过生物信息学预测lncRNAAK125910的下游靶基因为MUC2和SPAG4，并由RelatimePCR和western blot验证lncRNAAK125910增强MUC2的表达而抑制SPAG4的表达。
　　4.通过Relatime PCR和western blot对lncRNAAK125910在姜黄素抑制肝癌细胞增殖、侵袭相关蛋白表达的作用，lncRNA AK125910参与调控Bcl-2和BAX、caspase-3和-8、MMP-2和-9的表达。
　　结论:
　　1.肝癌细胞中lncRNAAK125910表达明显升高，姜黄素能下调肝癌细胞中lncRNAAK125910;
　　2.下调lncRNAAK125910的表达，能抑制肝癌细胞凋亡，促进肝癌细胞增殖和侵袭，姜黄素通过上调lncRNAAK125910而促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和侵袭;
　　3.lncRNAAK125910增强MUC2的表达而抑制SPAG4的表达，同时参与调控Bcl-2和BAX、caspase-3和-8、MMP-2和-9的表达。
　　4.姜黄素使肝癌细胞Bcl-2表达下降，而Bax表达增强，caspase-3和caspase-8表达增强，而MMP-2和MMP-9表达下降。下调lncRNAAK125910可以取消姜黄素上述作用，说明姜黄素通过lncRNAAK125910诱导肝癌细胞凋亡和抑制侵袭。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 理论研究与文献综述

1 中医化瘀解毒法辨治肝癌的理论基础研究

1．1 中医病名的探讨：肝癌论病以积为主

1．2 中医病因病机研究：肝癌病机以瘀毒为要

1．3 肝癌治疗需重化瘀解毒法

1．4 本项目以片姜黄作为肝癌防治研究切入点的依据

2 现代医学对肝癌发病机制和治疗研究进展

2．1 肝癌的危险因素

2．2 肝癌的发病机制

2．3 肝癌的临床治疗进展

2．4 存在问题与本研究的切入点

第三部分 实验研究

1 姜黄素处理肝癌细胞后IncRNA表达谱变化及关键IncRNA筛选

1．1 材料与方法

1．2 实验结果

1．3 小结

2 IncRNA AK125910在姜黄素处理肝癌细胞中的作用研究

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 小结

3 IncRNAAK125910在姜黄素抑制肝癌细胞中的分子机制研究

3．1 材料和方法

3．2 实验结果

3．3 小结

讨论

结语

创新性、存在问题与研究展望

参考文献

综述 姜黄素在肿瘤中的作用机制研究进展

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介