海洋药用生物星虫的资源化学与效应物质研究

摘要

本论文的研究内容主要包括建立特定的分析方法，对星虫中的核苷类成分、游离氨基酸类成分，脂肪酸类成分和无机元素类成分进行定性定量检测以及采用活性跟踪法对星虫中一种具有溶栓作用的活性蛋白——星虫激酶进行提取分离、纯化和制备，并对星虫激酶作用纤维蛋白和纤维蛋白原的作用机理、酶学性质、体内和体外水平的溶栓活性评价以及基于代谢组学对星虫激酶对动脉血栓形成的作用机制进行研究。
　　本论文共分三章，各章节的主要内容及研究结果如下:
　　一、文献研究
　　本部分总结中外学者的研究，简要介绍了星虫动物门的由来、分类和星虫的一般生理生态活性特征，并对星虫动物门的资源利用现状进行分析，肯定了我国在星虫人工养殖、新药开发和利用其作为污染物监测方面所取得的成就。重点介绍了星虫体内已经发现的营养活性物质、自身生理活性物质和药理活性物质以及星虫所具有的药理活性。
　　二、星虫资源化学成分评价
　　（一）核苷和游离氨基酸类成分资源化学评价
　　为了对星虫样品的核苷和游离氨基酸类成分进行资源化学评估，本实验采用HILIC-UPLC-TQ-MS/MS同时测定了不同产地、不同部位及不同方法处理的19批裸体方格星虫样品中的共计16种核苷类成分和25种游离氨基酸类成分。并采用了PCA的分析方法对各样品之间的差异进行了进一步的比较。结果显示所建立的测定的方法准确、快速、重现性好。41种成分的检测限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范围分别为0.003-0.229μg/mL和0.008-0.763μg/mL。日内精密度和日间精密度分别＜3.72％和＜3.42％。重复性的结果为＜4.48％，样品在一天内的0、2、4、8、12、24 h的稳定性＜4.92％。加样回收率的结果为94.03％-106.33％，相对标准偏差(RSDs)为＜3.76％。本实验中的相关研究成果将为星虫资源的深入研究和开发利用提供坚实的理论基础。
　　（二）脂肪酸类成分资源化学评价
　　为了对星虫样品的脂肪酸类成分进行比较和深入研究，本实验采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对12个裸体方格星虫样品中的26种脂肪酸进行了含量测定，对结果进行包括PCA分析在内的系统分析。结果显示所建立的测定方法检测限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范围分别为0.028-0.359mg/mL和0.093-1.197mg/mL。精密度和重复性的结果范围分别为0.53％-3.12％和0.18％-3.15％，样品在一天内的稳定性范围为0.78％-3.11％。加样回收率的结果的范围为94.20％-105.36％，相对标准偏差(RSDs)范围为1.13％-3.30％。对裸体方格星虫样品的测定结果显示各样品26种脂肪酸类成分总含量范围为198.20-578.05μg/g，总含量最低的样品是广西北海的裸体方格星虫外壁+内脏样品(S9)，总含量最高的样品是海南三亚的裸体方格星虫体腔液样品(S12);每个产地的裸体方格星虫的样本均呈现体腔液部位总含量高于外壁+内脏部位。
　　（三）无机元素类成分资源化学评价
　　为了对星虫样品的无机元素类成分进行比较和深入研究，本实验采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对采自7个产地的12个裸体方格星虫样品中的27种无机元素的种类、含量及所占比例进行了系统的分析，并采用了主成分分析法(PCA)对所得结果进行进一步探索。结果显示所建立的测定方法检测限(S/N=3)和定量限(S/N=10)范围分别为0.018-2.386μg/mL和0.060-7.953μg/mL。精密度和重复性的结果范围分别为0.03％-2.91％和0.69％-2.91％，样品在一天内的稳定性范围为0.13％-2.83％。加样回收率的结果的范围为96.17％-103.30％，相对标准偏差(RSDs)范围为1.01％-3.30％。用所建立的方法对裸体方格星虫样品中的分析结果显示各样品总含量范围为149.01-330.55μg/g，其中采自福建厦门的裸体方格星虫外壁+内脏样品(S4)总含量最低，采自海南三亚的裸体方格星虫体腔液样品(S12)总含量最高;每个产地的裸体方格星虫的体腔液的总含量均高于外壁+内脏的总含量;Na、K、Ca、Mg4种常量元素，总量范围为13.14-133.24μg/g。
　　三、星虫激酶提取分离纯化、酶学性质和体内外溶栓活性及机理研究
　　（一）星虫激酶提取分离纯化研究
　　采用纤溶活性跟踪的方法从裸体方格星虫中获取一种具有溶栓作用的活性蛋白酶——星虫激酶(SK)。取新鲜裸体方格星虫，洗净解剖后以PBS缓冲液为提取液经两次匀浆(1000r/min，30s)-冻融（20℃，12h冷冻，4℃解冻）-离心(5000 r/min，10 min，4℃)步骤后得到SK粗水提物。以30％-60％硫酸铵沉淀区间将SK粗水提物进行粗分离，再将经3500 D透析除盐除杂后的SK粗蛋白分别经Phenyl Sepharose High Performance疏水作用层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析结合3500 D透析或3000 D超滤等多步精制后得到SK。采用Native-PAGE和SDS-PAGE相结合电泳方法以及凝胶过滤色谱法对SK进行纯度鉴定;采用基质辅助激光解吸附联合飞行时间质谱法(MALDI-TOF)对SK进行分子量测定;采用经典的Edman降解法对SK进行N端序列测定。结果表明得到的SK的纯度分别达到了电泳纯和色谱纯，分子量为28003.67 D，N端序列为PFPVPDPFVWDTSFQ。
　　（二）星虫激酶酶学性质研究
　　为探究SK的酶学性质，采用纤维蛋白平板法分别测定SK经不同温度条件(10、20、30、40、50和60℃)作用，经不同pH缓冲液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)作用，与不同金属离子作用和不同抑制剂作用后的残余酶活。结果表明对SK的酶学性质的研究结果表明SK在经30-40℃区间温度作用后活性最大，60℃作用后基本失活;在pH8-9的范围内活性最大，pH=11时基本失活;各金属离子对SK的作用均不显著，其中Fe2+与SK作用最强，Na+与SK作用最弱;与SK作用的抑制剂中PMSF和Aprotinin与SK作用后，SK活性显著下降，其余三种均无显著作用，表明SK是一种丝氢酸蛋白酶。
　　（三）星虫激酶对纤维蛋白及纤维蛋白原的作用
　　采用纤维蛋白平板法研究设定的5个浓度的SK对纤维蛋白作用量效关系，以尿激酶为对照，进一步探究SK对纤维蛋白的作用;并采用SDS-PAGE法探究SK对纤维蛋白原的作用机制。结果表明一定剂量范围内，SK溶解纤维蛋白平板所形成的溶圈大小与其剂量存在一定的量效关系;在富含纤溶酶的未经任何处理的纤维平板上，SK可以通过激活纤溶酶原作用纤维蛋白，在不含纤溶酶的经85℃加热纤维平板上，SK可以直接作用于纤维蛋白;对与SK分别经5、10和30min以及1、2、4、6、8和16h降解反应后的纤维蛋白原进行凝胶电泳分析后发现SK通过依次对纤维蛋白原的α链、β链和γ链进行降解而对其起作用的;SK不仅可以直接作用纤维蛋白，还可以通过激活纤溶酶原间接作用纤维蛋白。
　　（四）星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的作用
　　采用FeCl3刺激诱导的大鼠动脉血栓模型来探究SK对体内血栓形成的作用，通过对动脉血栓质量的测定、HE染色动脉血栓组织形态学的观察以及包括凝血四项(APTT、TT、PT和FIB)、血小板最大聚集率(ADP％)以及TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2在内的血液指标的变化进行评估。结果表明一定剂量范围内，与模型组相比，SK对大鼠动脉血栓的形成具有显著抑制作用，并能显著改善血管组织形态，对动脉血栓模型大鼠的凝血四项（APTT、PT、TT和FIB）、血小板最大聚集率(ADP％)、TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGF1α和PGI2也均有显著改善，并且随剂量递增，改善作用增强。
　　（五）基于代谢组学的星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的作用机理研究
　　本研究中采用UHPLC-Q-TOF-MS分析技术和代谢组学研究方法对动脉血栓模型大鼠在星虫激酶干预治疗下血栓形成过程中大鼠尿液和血浆的代谢组变化进行了研究，从血栓形成过程中内源性物质多元变化，特征标志物上调与下调以及相关代谢通路构建多角度探讨和推测星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的作用机制。通过主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)对假手术组、动脉血栓模型组以及星虫激酶给药组的尿液和血浆样品进行多元分类分析，结果显示假手术组、模型组与星虫激酶给药组均可以显著分开。对组间差异的进一步分析，鉴定出9个生物标志物。动脉血栓模型组大鼠中的白三烯C4、血栓素A2、二氢神经鞘氨醇、植物二氢神经鞘氨醇、花生四烯酸和溶血性磷脂酰胆碱类与假手术组大鼠比较有上调趋势;二氢神经酰胺和色胺与假手术组大鼠相比有下调趋势。星虫激酶对大鼠动脉血栓形成中的代谢紊乱有显著改善作用，并呈现趋向正常的趋势。本实验研究结果表明，基于代谢组学对星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的影响对其作用机理的推测和阐明具有重要作用。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 文献研究

第一节 星虫动物门的基本介绍

第二节 星虫动物门活性成分

第三节 星虫动物门药理作用研究

本章小结

参考文献

第二章 星虫资源化学成分研究

第一节 核苷和游离氨基酸类成分资源化学评价

第二节 脂肪酸类成分资源化学评价

第三节 无机元素类成分资源化学评价

参考文献

第三章 星虫激酶分离纯化及其性质和活性研究

第一节 星虫激酶分离纯化研究

参考文献

第二节 星虫激酶的酶学性质研究

第三节 星虫激酶对纤维蛋白和纤维蛋白原的作用

第四节 星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的作用

参考文献

第五节 基于代谢组学的星虫激酶对大鼠动脉血栓形成的作用机理研究

参考文献

结语

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢