龟鹿二仙胶对成骨细胞Ⅰ型胶原基因表达的实验研究

摘要

背景:
　　研究表明Ⅰ型胶原与骨质疏松症(Osteoporosis，OP)有着密切联系。Ⅰ型胶原由Col1a1及Col1a2基因编码，可受转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)调控。TGF-β1、TGF-β2是TGF-βs的两个异构体。中药龟鹿二仙胶可以治疗骨质疏松症，以往研究多以临床疗效观察为主，与Ⅰ型胶原有关的研究较少。
　　目的:
　　研究龟鹿二仙胶对成骨细胞Ⅰ型胶原基因表达的影响，探索龟鹿二仙胶治疗OP的机制。
　　方法:
　　取SD大鼠100只，随机分为空白组、龟鹿二仙胶组（低剂量）、龟鹿二仙胶组（中剂量）、龟鹿二仙胶组（高剂量）、骨化三醇组。每天灌胃1次，持续7d，末次给药2h后腹主动脉采血制成含药血清条件培养基培养成骨细胞。通过MTT法及活细胞形态观察来了解含药血清对成骨细胞增殖及凋亡的影响。应用Western Blot法检测各组成骨细胞Ⅰ型胶原及TGF-β蛋白表达水平。运用PCR(RT-PCR)技术检测各组成骨细胞Ⅰ型胶原及TGF-β的mRNA表达。
　　结果:
　　(1) MTT结果显示:龟鹿二仙胶各组的成骨细胞无明显增殖。骨化三醇组的成骨细胞有明显增殖(P＜0.05)。细胞活细胞染色提示:骨化三醇组及龟鹿二仙胶各组的成骨细胞无显著的凋亡。
　　(2) RT-PCR法结果显示:骨化三醇组与龟鹿二仙胶各组Col1a1及Col1a2mRNA的水平均有增加(P＜0.01);龟鹿二仙胶中、高剂量组Col1a1及Col1 a2mRNA水平增加较明显(P＜0.05)，龟鹿二仙胶高剂量组较中剂量组Col1a1及Col1 a2mRNA水平增加不明显(P＞0.05);骨化三醇组TGF-β1及TGF-β2 mRNA水平无明显变化(p＞0.05);龟鹿二仙胶各组TGF-β1及TGF-β2 mRNA水平均有增加(P＜0.01);且龟鹿二仙胶中、高剂量组TGF-β1、TGF-β2 mRNA水平增加一致，比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　(3) Western blot结果提示:第24小时，龟鹿二仙胶高剂量组能使成骨细胞Col1a1及Col1a2蛋白合成增加(P＜0.05)。第48小时，骨化三醇组、龟鹿二仙胶各组均能使成骨细Col1a1及Col1a2蛋白合成增加(P＜0.01);龟鹿二仙胶高、中剂量组之间比较差异没有统计学意义(P＞0.05);第24、48小时，骨化三醇组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成无明显变化(P＞0.05);在24小时，龟鹿二仙胶高剂量组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成有显著增强(P＜0.01)，龟鹿二仙胶低、中剂量组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成无明显变化(P＞0.05);48小时，龟鹿二仙胶各组TGF-β1及TGF-β2蛋白合成增加(P＜0.01)。龟鹿二仙胶高、中剂量组之间无显著区别(P＞0.05)。
　　结论:
　　龟鹿二仙胶可以促进Ⅰ型胶原基因的表达，其机制可能与调节细胞因子TGF-β有关。

目录

声明

摘要

前言

第一章 理论研究

1．OP的概念及分类

2．OP的诊断及危害

3．现代医学对OP病因的认识

3．1 内分泌因素

3．2 营养因素

3．3 年龄及性别因素

3．4 疾病及药物因素

3．5 遗传及免疫因素

3．6 废用性及环境因素

4．OP的中医病因病机

4．1 肾虚

4．2 肝郁

4．3 脾胃虚弱

4．4 瘀血阻滞

5．Ⅰ型胶原与OP的关系

6．Ⅰ型胶原蛋白的基因、结构及合成

7．TGF-β及其信号通路

7．1 TGF-β的定义及受体

7．2 TGF-β的生物功能

7．3 TGF-β的信号转导

8．龟鹿二仙胶的临床运用

8．1 骨相关疾病

8．2 神经系统疾病

8．3 血液系统疾病

8．4 生殖系统异常

8．5 身体保健方面

第二章 实验研究

实验目的

实验材料

实验一 龟鹿二仙胶对成骨细胞细胞活性的影响

1、试剂的配制

2、实验方法

3、实验结果

实验二 PCR(RT-PCR)检测各组成骨细胞TGF-β1、TGF-β2、Colla1、Colla2mRNA的表达

1、实验材料的处理

2、实验方法

3、实验结果

实验三 Western Blot检测各组成骨细胞TGF-β1、TGF-β2、Colla1、Colla2蛋白的表达

1、细胞培养、传代：同实验一

2、含药血清的制备：同实验一

3、蛋白样品的制备

4、Westen blot实验中各试剂配制

5、电泳

6、转膜

7、封闭

8、一抗孵育

9、二抗孵育

10、蛋白检测

11、统计学方法

12、实验结果

第三章 分析与讨论

1．本次研究的依据

1．1 Ⅰ型胶原蛋白的生物学效应

1．2 Ⅰ胶原蛋白与骨质疏松症之间的遗传学关系

1．3TGF-β、成骨细胞及Ⅰ型胶原之间的联系

1．4 龟鹿二仙胶关于Ⅰ型胶原的研究

2．本次研究的意义

3．实验结果讨论

4．本次实验的不足及展望

参考文献

中英文缩略词表

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢