丹酚酸组分结构特征解析及整体生物药剂学性质的表征

摘要

中药中已知或未知的化学成分有数十乃至成百上千种，各化学成分的含量和生物活性存在差别，进行中药组分及其制剂的评价时，不能兼顾每一个成分，如何在中药众多的化学成分中选择指标性成分用以研究组分的整体性质，进而反映中药的整体性特点，这是中药制剂研究的当务之急。随着现代科学技术的不断发展，中药制剂的研究也渐渐深入到组分层次。本课题基于中医药整体观，以丹酚酸组分为研究模型，初步探讨了以中药组分为基础的中药制剂研究新思路。主要研究内容如下:
　　第一章对中药组分生物药剂学分类系统的构建以及丹酚酸组分化学成分和防治脑缺血药理作用的研究进展做了整体阐述。在中医药理论的指导下，从中药物质基础研究的发展历程、有限个代表性成分论“N”、表征组分整体性质的数理模型、组分生物药剂学分类系统的构建等方面探讨了中药制剂研究的新模式。并对丹酚酸组分的化学成分、丹参防治脑缺血疾病的作用机制及研究进展这两个方面做了深入的总结和阐述。
　　第二章首先模拟体内血脑屏障，建立体外血脑屏障(BBB)模型，并运用该模型从体外的角度快速筛选出丹酚酸组分中可能作用于中枢神经系统疾病的药效成分。结果表明利用该模型从丹酚酸组分中筛选出至少有6种成分能够穿越BBB模型，这6中成分被确认为丹参素、原儿茶酸、咖啡酸、异阿魏酸、紫草酸、迷迭香酸。其次采用人脑微血管内皮细胞的缺糖缺氧(OGD)模型优化筛选丹酚酸组分中代表性成分。对细胞形态学观察表明，丹酚酸组分及各有效成分组合均能有效减轻缺氧对细胞形态的损伤，其中迷迭香酸+丹参素+原儿茶酸+异阿魏酸+咖啡酸（主成分A）组和迷迭香酸+丹参素+原儿茶酸+异阿魏酸+咖啡酸+紫草酸（主成分B）组对细胞保护作用较好;相关生化因子的测定结果表明，丹酚酸组分及主成分B均能减轻氧化损伤(T-SOD、MDA、GSH-PX和CAT)，缓解细胞的缺氧损伤，降低炎症因子(TNF-α、IL-6、sICAM-1)的表达从而达到保护脑微血管内皮细胞，缓解缺血后神经功能的损伤的目的，且无显著差异(P＞0.05)。对细胞中MMP-9、VEGF蛋白的表达及MMP-9、VEGF mRNA的表达结果表明，主成分B组与丹酚酸组分相比无统计学差异（P＞0.05）。
　　第三章采用MCAO模型验证丹酚酸组分的代表性成分。结果表明丹酚酸组分及主成分B组均具有保护脑缺血损伤的功效，且无显著差异:即可显著减轻脑缺血大鼠神经功能缺损、减少脑梗死面积;改善氧化指标:升高SOD、CAT、GSH-PX，降低MDA含量;提高VEGF、TIMP-1表达，降低p-p38MPAK、TLR-4、NFkBp65、Caspase-3、 MMP-2、MMP-9表达;下调bax表达，上调bcl-2表达，抑制了细胞的凋亡;降低NMDAR1 mRNA表达及增加VEGF mRNA的表达。
　　第四章采用HPLC解析丹酚酸组分代表性成分的结构。最终确定丹参素、原儿茶酸、咖啡酸、异阿魏酸、紫草酸、迷迭香酸在组分中的含量分别为12.47％、3.98％、3.01％、6.05％、7.36％和20.96％，相互之间的量比关系丹参素∶原儿茶酸∶咖啡酸∶异阿魏酸∶迷迭香酸∶紫草酸为4.14∶1.32∶1.00∶2.01∶6.93∶2.45。
　　第五章测定了前文所筛选得到的代表性成分的平衡溶解度、表观油水分配系数和Caco-2细胞渗透性等性质值，并运用数学模型对它们的性质值进行相似性分析和进一步整合表征。结果显示，丹酚酸组分的平衡溶解度最大值为28.1271 mg·mL-1，最小值为6.20384mg·mL-1，组分油水分配系数LogP最大值是1.387，最小值是于0.037，Caco-2细胞的表观通透系数Papp拟合数值为0.693×10-6 cm·s-1。表明丹酚酸组分水溶性良好，脂溶性差，属于Ⅲ型药物。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 绪论

1．1 以组分为特征的现代中药制剂的研究

1．1．1 中药制剂发展的方向--以组分为基本制剂单元

1．1．2 中药组分制剂的基础--药效物质基础相对明确

1．2 组分性质表征的技术研究

1．2．1 有限个代表性成分论“N”

1．2．2 组分理化性质的分析研究

1．2．3 组分整体性质的数据处理方法

1．3 组分生物药剂学分类系统的构建

1．3．1 生物药剂学性质的研究状况

1．3．2 中药组分生物药剂学分类系统的构建

1．3．3 生物药剂学分类对组分制剂设计的意义

1．4 丹酚酸组分的文献研究

1．4．1 丹酚酸组分的化学成分研究

1．4．2 丹参防治脑缺血疾病的研究进展

1．5 研究思路与技术路线

参考文献

第二章 体外药效实验初步筛选表征丹酚酸组分整体性质的代表性成分研究

2．1 HBMEC／HA共培养模拟血脑屏障模型初步筛选丹酚酸组分代表性成分

2．1．1 实验材料

2．1．2 体外BBB模型的建立

2．1．3 丹酚酸组分样品的制备与代表性成分的筛选

2．1．4 色谱分析

2．1．5 质谱解析

2．1．6 讨论

2．2 HBMEC的缺糖缺氧模型优选丹酚酸组分代表性成分

2．2．1 丹酚酸组分对HBMEC的体外毒性实验

2．2．2 HBMEC缺糖、缺氧损伤模型的建立

2．2．3 HBMEC的OGD模型计算丹酚酸组分代表性成分的贡献度

2．2．4 HBMEC的OGD模型优选丹酚酸组分的代表性成分

2．2．5 讨论

2．3 本章小结

参考文献

第三章 体内脑缺血模型验证丹酚酸组分的代表性成分研究

3．1 线栓法制备大鼠MCAO模型

3．1．1 实验材料

3．1．2 造模方法

3．2 丹酚酸组分及各成分组合对大鼠脑缺血后神经功能缺损评分的影响

3．2．1 实验材料与分组

3．2．2 实验方法与结果

3．3 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血后大鼠脑梗死面积比的影响

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验方法与结果

3．4 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血大鼠血清抗自由基氧化影响

3．4．1 实验材料

3．4．2 实验方法与结果

3．5 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血大鼠脑组织病理改变的影响(HE)

3．5．1 实验材料

3．5．2 实验方法与结果

3．6 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血大鼠脑组织免疫组化影响结果

3．6．1 实验材料与分组

3．6．2 实验方法及结果

3．7 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血大鼠脑内蛋白表达的影响

3．7．1 实验材料与组别

3．7．2 实验方法与结果

3．8 丹酚酸组分及各成分组合对脑缺血大鼠脑内mRNA表达的影响

3．8．1 实验材料

3．8．2 实验方法与结果

3．9 本章小结

参考文献

第四章 丹酚酸组分含量测定方法学建立及其结构特征分析

4．1 丹酚酸组分含量测定方法的建立

4．1．1 实验材料

4．1．2 色谱条件

4．1．3 供试品溶液的制备

4．1．4 标准曲线的制备

4．1．5 方法学考察

4．2 丹酚酸组分结构特征分析

4．3 本章小结

参考文献

第五章 丹酚酸组分生物药剂学性质的研究

5．1 丹酚酸组分在水及不同pH的磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法与结果

5．1．3 讨论

5．2 丹酚酸组分在正辛醇-水(不同pH缓冲液)中的分配系数

5．2．1 实验材料

5．2．2 丹酚酸组分正辛醇-水(不同pH缓冲液)分配系数的测定

5．2．3 讨论

5．3 Caco-2细胞模型测定丹酚酸组分的渗透性

5．3．1 实验材料

5．3．2 各代表性成分的含量测定

5．3．3 细胞毒性实验

5．3．4 丹酚酸组分代表性成分在pH7．4的HBSS缓冲溶液中稳定性考察

5．3．5 丹酚酸组分中代表性成分在Caco-2细胞中代谢稳定性考察

5．3．6 转运试验与结果

5．4 丹酚酸组分中各代表性成分性质值的相似性分析

5．4．1 基本方法

5．4．2 对各代表性成分平衡溶解度的性质值进行分析

5．4．3 对各代表性成分油水分配系数的性质值进行分析

5．4．4 丹酚酸组分中各代表性成分的Caco-2渗透性分析

5．4．5 讨论

5．5 丹酚酸组分整体生物药剂学性质的整合表征

5．5．1 丹酚酸组分各代表性成分的质量权重系数的确定

5．5．2 丹酚酸组分整体性质的表征结果

5．5．3 讨论

5．6 本章小结

参考文献

第六章 总结与展望

6．1 研究创新点

6．2 主要结论

6．3 工作展望

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢