ICA69与葛根芩连汤在疼痛发生与治疗中的作用机制研究

摘要

目的:观察胰岛细胞自身抗原蛋白69(Islet cell antigen protein69，ICA69)表达的改变对实验动物热痛、机械痛和炎症性疼痛行为的影响，以此判断ICA69在不同疼痛模型中的作用，即ICA69与疼痛类型之间的关系，并探讨其相关机制。预实验结果显示，ICA69可以显著炎症性疼痛动物行为学，所以进一步期望从ICA69缺失与神经系统功能和ICA69缺失与炎症发生关系两个角度，探讨研究ICA69影响炎症性疼痛的具体机制，为疼痛的诊治提供基础研究的依据，为进一步研发疼痛治疗药物与疼痛治疗方法拓展思路。观察葛根芩连汤对糖尿病疼痛的治疗作用，并基于ICA69进一步进行机制研究。
　　方法:(1)统计分析野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在甩尾实验、Von Frey机械刺激实验、甲醛皮下注射炎症痛实验中行为学结果，并进行比较，观察ICA69缺失后对3种疼痛行为的影响。(2)应用逆转录PCR技术检测神经系统中ICA69的表达情况，并通过免疫组织荧光染色(Immunofluorescence staining，IF)得到背根神经节(Dorsal root ganglia，DRG)中ICA69阳性神经元的分子特性，并比较与炎症性相关的重要分子，包括非选择性阳离子通道瞬时感受器电位通道V1、A1(Transient receptor potential cation channel V1、A1，TRPV1、TRPAl)和降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）在ICA69缺失后，生理状况下的表达情况。(3)应用蛋白免疫印迹方法(Western blot，WB)检测炎症模型动物中ICA69本身在炎症局部和背根神经节神经元的表达水平。应用免疫荧光染色比较野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在病理状态下炎症性疼痛相关分子的表达情况。(4)提取野生型小鼠和ICA69-/-小鼠炎症局部皮肤释放物，以此作为刺激物分别对野生型小鼠和ICA69-/-小鼠的原代DRG神经元进行钙离子成像研究，判断ICA69参与炎症性疼痛干预的机制。(5)根据上述实验结果，探讨ICA69在炎症发生过程中的作用及机制。制备甲醛炎症疼痛模型后，观察野生型小鼠和ICA69-/-小鼠局部肿胀情况，以及局部形态学变化。应用逆转录PCR检测重要的炎症细胞（巨噬细胞、肥大细胞）中ICA69是否表达，同时检测炎症局部释放物中肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等细胞因子的表达水平。最后通过甲醛刺激原代巨噬细胞实验检测ICA69缺失对核转录因子NF-κB激活的影响。(6)通过腹腔单次大剂量注射链脲佐菌素(STZ)制备小鼠糖尿病疼痛模型，模型制各后给予葛根芩连汤水煎液灌胃，观察该方剂对模型小鼠血糖、体重、疼痛行为的影响，并进一步检测其对小鼠胰腺组织ICA69表达水平和血清炎症因子水平。
　　结果:(1)ICA69的缺失能够显著减少实验动物在甲醛所导致的炎症性疼痛中的疼痛行为(P＜0.01)，但对实验动物的热痛行为学和机械痛行为学未见显著影响。(2)ICA69在外周神经系统中存在表达，其阳性神经元多为小直径的肽能无髓鞘神经元，ICA69的缺失对瞬时电压门控阳离子通道V1(Transient receptor potential cation channel V1，TRPV1)、瞬时电压门控阳离子通道A1（Transient receptor potential cation channel A1，TRPA1）和降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）等在炎症性疼痛中扮演重要角色的分子表达无显著影响。(3)甲醛致痛的模型组小鼠炎症局部和DRG中ICA69的表达水平与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，同时ICA69-/-小鼠进行造模处理后，TRPV1、TRPA1和CGRP等分子的表达情况与野生型模型鼠比较亦无显著性差异(P＞0.05)。(4)钙离子成像结果显示:野生型小鼠和ICA69-/-小鼠DRG神经元对相同的刺激物的反应无显著性差异(P＞0.05)，而野生型模型小鼠炎症皮肤释放物所引起的神经元细胞反应比例显著高于ICA69-/-模型小鼠(P＜0.05)，提示两种皮肤释放物的组成存在显著差异，ICA69可能参与了炎症的发生过程而对神经系统功能的影响不明显。(5)肿胀度检测实验和病理学染色实验均提示ICA69缺失后造模，实验动物炎症局部肿胀程度显著降低(P＜0.05);逆转录PCR结果显示在巨噬细胞和肥大细胞中均存在ICA69的表达;ELISA检测野生型模型鼠和ICA69-/-模型小鼠炎症局部皮肤释放物中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平，结果显示前两者在ICA69-/-模型小鼠炎症局部皮肤释放物中显著低表达(P＜0.05);原代细胞培养巨噬细胞，进行核转录因子NF-κB激活检测实验，结果显示ICA69缺失后，在甲醛和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，与野生型小鼠巨噬细胞比较，ICA69-/-原代巨噬细胞核转录因子NF-κB的激活程度显著降低(P＜0.05)。(6)葛根芩连汤能够显著逆转由于STZ造模所引起的动物体重、血糖的改变，同时模型小鼠对热刺激(P＜0.01)、机械刺激(P＜0.01)、冷刺激(P＜0.05)的痛阈降低也可以被葛根芩连汤逆转。葛根芩连汤能够显著降低造模引起的胰腺组织ICA69表达增高，同时模型小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-1β也通过给予葛根芩连汤被显著降低。
　　结论:(1)ICA69在外周神经系统和免疫细胞中存在表达;(2)ICA69参与了甲醛所致的炎症性疼痛;(3)ICA69敲除后可以减弱核转录因子NF-κB的激活，抑制炎症早期重要细胞因子TNF-α、IL-1β的生成，降低炎症程度从而使炎症性疼痛减轻。(4)葛根芩连汤能够有效改善糖尿病疼痛模型小鼠的疼痛行为变化，其机制可能通过降低ICA69的表达从而减弱慢性炎症发挥作用。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 理论研究

第一章 疼痛的流行病学及机制的研究进展

1 疼痛的发病概况

2 疼痛的分型

3 疼痛产生的主要机制

4 疼痛的临床治疗

5 小结

第二章 炎症相关性疼痛研究进展

1 炎症相关性疼痛发生机制

2 炎症相关性疼痛动物模型

3 炎症相关性疼痛的治疗

4 小结

第三章 中医学对疼痛的认识

1 中医学对“疼痛”的记载

2 疼痛的病因病机

3 中医对疼痛的治疗

4 小结

第四章 胰岛细胞自身抗原蛋白(ICA69)的研究进展

1 ICA69的分子结构和组织分布

2 ICA69与相关疾病

3 小结

第二部分 实验研究

第一章 ICA69敲除对C57BL／6N小鼠疼痛行为学的影响研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第二章 生理状态下ICA69外周神经系统表达及其阳性神经元生理特性研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 炎性痛模型中ICA69及炎症疼痛相关分子TRPV1、TRPA1和CGRP表达研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第四章 ICA69参与炎性疼痛的机制研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第五章 ICA69敲除对炎症影响的机制研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第六章 葛根芩连汤改善小鼠糖尿病神经性疼痛的作用及机制研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

全文总结

参考文献

附录 缩略语中英文对照表

攻读博士学位期间取得的学术成果

致谢

作者简介