金荞麦对溃疡性结肠炎的抗炎作用及机制研究

摘要

目的：
　　溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种，中医学归于“腹痛”、“泄泻”、“便血”等范畴。其病因尚不十分明确，现代研究表明核转录因子-κB(nuclear factor，NF-κB)信号通路、炎症小体信号通路（Inflammasome）NLRP3与溃疡性结肠炎的发生、发展密切相关，并导致一系列炎症因子的释放。目前，临床上缺乏对UC的有效且副作用少的治疗药物，中草药因其安全、低毒、有效等优点受到广泛关注。
　　金荞麦（Fagopyrumcymosum，FAG），是一种蓼科的草本植物根茎和荞麦物种，传统被广泛用于治疗肺炎，菌痢等，临床及实验研究表明，FAG对腹泻性肠易激综合征治疗亦有效，其机制可能与其抗炎、肠黏膜保护作用相关，但目前未见金荞麦对溃疡性结肠炎的作用及机制的深入研究报道。本课题拟从以下四部分研究:一:金荞麦提取物中主要活性成分在溃疡性结肠炎小鼠胃肠道的分布研究;二:金荞麦提取物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的药效学研究;三:金荞麦提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠药效学研究;四:从NF-κB及NLRP3信号通路角度研究金荞麦提取物的抗炎机制。期望通过上述研究，进一步确证金荞麦提取物对溃疡性结肠的治疗作用，并初步探讨其机制。
　　方法：
　　1、首先建立采用HPLC法同时测定了金荞麦提取物中原儿茶酸，儿茶素，表儿茶素，原花青素B1，原花青素B2的分析方法。采用外标法，求得样品中原儿茶酸的含量为6.98mg/g，儿茶素的含量为2.64mg/g，表儿茶素的含量为17.84mg/g，原花青素B1的含量为4.07mg/g，原花青素B2的含量为8.43mg/g。在此基础上，我们建立了同时测定小鼠生物样品中儿茶素，表儿茶素，原花青素B1，原花青素B2的LC-MS/MS分析方法，并进行专属性、线性、回收率、准确度、精密度的考察。采用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型，正常小鼠及溃疡性结肠炎小鼠分别给予金荞麦提取物(2.28g/kg)，于不同时间点取血浆、肝脏、空肠、结肠。结果表明儿茶素、原花青素B1和原花青素B2在溃疡性结肠炎小鼠中的系统暴露程度均有所增加。组织分布结果显示金荞麦中主要活性成分儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2在溃疡性结肠炎小鼠的肝脏组织、空肠、结肠组织中的浓度较正常组高。提示在病理状态下，这些成分的高浓度分布，可以有效的保证其效应的发挥。
　　2、采用TNBS诱导小鼠结肠炎，使用不同剂量的Fag提取物(0.57，1.14，2.28g/kg)和柳氮磺吡啶(SASP，200mg/kg)，观察体重变化，结肠长度，对结肠组织H&E染色并病理学评分，测定炎症细胞浸润情况（F4/80标记阳性），测定结肠髓过氧化物酶(MPO)活性，血浆中的LPS和促炎细胞因子水平，以及促炎细胞因子mRNA在结肠中表达情况。结果表明金养麦提取物可显著改善由TNBS诱导的小鼠体重减轻、结肠缩短，降低结肠病理评分及MPO活性。同时金荞麦提取物可显著抑制TNBS引起的小鼠结肠组织中IL-6，IL-1β和TNF-α的mRNA表达，降低溃疡性结肠炎小鼠血浆中的LPS，IL-6，IL-1β和TNF-α，进而发挥其抗炎效应。
　　3、采用DSS诱导溃疡性结肠炎，使用不同剂量的Fag提取物和柳氮磺吡啶，观察小鼠体重变化，结肠长度，结肠组织H&E染色，测定结肠髓过氧化物酶(MPO)活性，促炎细胞因子mRNA在结肠中表达情况、结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1，Occluidn表达，以FD4为底物研究其胃肠道通透性，血浆中的LPS、IL-6、TNF-α和IL-10水平，并对其结肠组织中NF-κB的表达进行研究。结果表明金荞麦提取物可显著改善由DSS诱导的小鼠体重减轻、结肠缩短，降低结肠病理评分及MPO活性。同时金荞麦提取物可显著抑制DSS引起的小鼠结肠组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达，增加IL-10的mRNA在结肠组织中的表达，抑制结肠组织中NF-κB表达，降低DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠血浆中LPS、IL-6和TNF-α的浓度。此外金荞麦提取物还可以显著降低由DSS诱导的肠黏膜屏障功能损伤，并增加紧密连接蛋白ZO-1和occludin在结肠组织中的表达。
　　4、采用LPS分别刺激RAW264.7细胞，THP-1细胞，研究金荞麦提取物(5，10，20，50μg/mL)对IL-6和TNF-α分泌的影响、Cox-2和iNOS的表达、NF-κB核易位情况及对核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor3，NLRP3)信号通路的影响。结果表明金荞麦提取物可剂量依赖性的降低IL-6和TNF-α的分泌，抑制由LPS诱导的Cox-2和iNOS表达上调，同时金荞麦提取物可显著抑制NF-κB的核易位，可能与其抑制IκB磷酸化有关。此外在THP-1细胞中，研究发现，金荞麦提取物可以显著抑制Cleaved Caspase-1，IL-1β，NLRP3和ASC的相对蛋白表达量，从而发挥其抗炎作用。
　　结论：
　　本研究通过体内和体外实验两个方面证实，Fag可显著改善溃疡性结肠炎引起的肠黏膜屏障功能损伤、抑制结肠组织中炎症反应的过度激活。其抗炎作用可能来源于其抑制NF-κB p65核易位和IκB磷酸化，最终抑制NF-κB信号通路而发挥抗炎作用。同时其抗炎作用可能与金荞麦提取物抑制NLRP3信号通路有关。本研究初步表明Fag可能将成为UC新的治疗手段和防治药物。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

第一章 溃疡性结肠炎的中医学认识

1 病因病机的认识

2 中医辨证分型

3 中医治法治则

第二章 溃疡性结肠炎的现代医学研究

一、病理生理学机制

二、现有溃疡性结肠炎治疗药物的局限性

第三章 溃疡性结肠炎相关炎症通路的研究

一、NF-κ B信号通路

二、NLR炎症通路

第四章 金荞麦的研究进展

第一节 金荞麦的中药特性

第二节 金荞麦的临床应用

第三节 金荞麦化学成分及药理学研究

第二部分 实验研究

第一章 金荞麦中主要活性成分在溃疡性结肠炎小鼠胃肠道分布研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二章 金荞麦提取物对TNBS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的药效学研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 金荞麦提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的药效学研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 金荞麦提取物的体外抗炎活性及机制研究

第一节 金荞麦的体外抗炎活性研究

第二节 金荞麦提取物对NF-κB通路的影响

第三节 金荞麦提取物对炎症小体NLRP3通路的影响

结语

文献综述

参考文献

附录英文缩略语

攻读博士学位期间取得的学术成果

攻读博士学位期间主持及参与的科研项目

致谢

个人简历