基于IL--4、IL--13膜受体表达调控STAT--6信号通路探讨平哮颗粒治疗支气管哮喘大鼠模型的作用机理研究

摘要

背景: 平哮颗粒是导师史锁芳教授治疗支气管哮喘的经验方，前期临床观察显示其疗效确切，但其作用机制目前尚不明确，本研究立足于IL-4Rα、IL-13Rα1、IL-13Rα2的表达进而调控STAT-6的信号通路，探讨平哮颗粒治疗支气管哮喘的作用机理。 目的: 阐明平哮颗粒通过IL-4、IL-13膜受体表达调控STAT-6信号通路治疗支气管哮喘的作用机理，同时为临床运用平哮颗粒有效治疗哮喘提供分子生物学佐证。 方法: 清洁级SD大鼠60只，随机平均分为空白组、哮喘模型组、地塞米松组、平哮低剂量组、平哮高剂量组等五组，每组雌雄各半。除空白组以外，各组腹腔注射“鸡卵蛋白+Al(OH)3混悬液”和灭活百日咳杆菌致敏，并通过OVA雾化吸入诱发哮喘，建立模型;空白组予腹腔注射等量生理盐水，并且予蒸馏水雾化吸入作为对照组。模型建立后，实验各组分别给予对应的药物治疗，空白组给予蒸馏水灌胃以作对照。实验过程中密切观察大鼠症状，并通过哮喘行为学评分评估。药物干预14天后，处死大鼠，取大鼠血清及肺组织标本。检测:1）肺组织H.E染色，光镜下观察病理变化;2)Giemsa染色，光镜下观察嗜酸性粒细胞浸润情况;3)ELISA法检测血清IL-4、IL-12、IL-13浓度变化;4)Western-Blot检测肺组织pSTAT-6表达情况;RT-PCR检测肺组织IL-4Rα、IL-13Rα1/α2表达情况。 结果: 1)实验采用OVA、Al(OH)3和百日咳杆菌等联合致敏、诱喘的造模法，切合哮喘动物模型基本特征，符合实验研究要求，构建过敏性哮喘大鼠模型成功。 2)HE染色:空白组肺组织未见明显改变;模型组支气管壁明显增厚，管腔内现渗出物，肺间质现嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等大量炎细胞浸润，纤维结缔组织增生等;其余三组可见少数支气管平滑肌轻度增厚，肺间质现少许炎细胞浸润。 3)Giemsa染色:模型组可见较多嗜酸性粒细胞浸润，空白组未见明显异常，其余各可见少许嗜酸性粒细胞浸润。 4)ELISA检测:①IL-4水平比较:五组之间并未见明显差异，无显著统计学意义(P＞0.05)。②IL-13水平比较:与模型组相比，地米组IL-13水平显著偏低(P＜0.05)，但模型组与其余各组IL-13水平相当，空白组与其他组水平相当，无统计学意义。③IL-12测出OD值几乎都为负值，无意义。 5)Western Blot检测:哮喘大鼠STAT-6水平五组分析比较显示，模型组与中高、地米、空白组三组存在差异(p＜0.05)，并且模型组与空白组存在显著性差异(p＜0.01)，但模型组与中低组水平相当(P＞0.05);空白组STAT-6水平与其余四组存在显著性差异(p＜0.01)。中高组与地米组无明显差异，中药高低两组水平相当(P＞0.05)。 6)RT-PCR检测:①L-4R mRNA比较:模型组明显高于其余四组(P＜0.05)，且模型组和地米组、中药组以及空白组存在显著性差异(p＜0.01);而空白组明显低于模型和中低组，且差异显著(P＜0.01)，但与其余两组水平相当，无统计学意义;中高组与地米组和中低组无明显差异。②IL-13Rα1mRNA比较:模型组明显高于其余四组，差异有统计学意义(p＜0.05)，且空白组、地米组及中高组与模型组比较有显著性差异(p＜0.01);空白组明显低于模型、中高、中低组，差异有统计学意义(p＜0.05)，并且模型、中低组先与空白组有显著性差异(p＜0.01);地米组与中高组水平相当，无明显差异(P＞0.05)，但与中低组比存在差异性，有统计学意义(p＜0.05);中药高低两组水平相当，无统计学意义(P＞0.05)。③IL-13Rα2mRNA比较:模型组水平明显高于其余四组，具有显著统计学意义(P＜0.05)，并且模型组与地米组、中高组及空白组存在显著性差异(p＜0.01);空白组与模型组比较，水平明显偏低，且差异显著(P＜0.01)，但与其余三组水平相当，无明显差异(P＞0.05)。地米、中高、中低三组水平相当(p＞0.05)。 结论: 大鼠肺组织病理和相关炎症指标经平哮颗粒和地塞米松干预治疗后得到改善。平哮颗粒通过分别抑制IL-4和IL-13的膜受体IL-4R、IL-13Rα1/α2，从而抑制STAT-6磷酸化，减少Th2型细胞因子释放水平，使炎症反应向Th1方向偏移。这可能是平哮颗粒治疗过敏性哮喘的机制之一。

目录

声明

摘要

前言

第一部分研究背景

1．平哮颗粒治疗哮病的中医学理论探讨

1．1哮病中医辨证

1．2平哮颗粒的由来及组方应用

2．支气管哮喘免疫学机制及国内外研究进展

2．2 JAK-STAT信号通路及相关细胞因子与哮喘

2．3 IL-4、13／STAT-6及相关膜受体与支气管哮喘

第二部分实验部分

1．2实验方法

2．检测方祛

2．1病理检测

2．2 WB法检测STAT-6蛋白水平表达

2．3 RT-PCR检测肺组织IL-4R IL-13Rα1、IL-13Rα2表达

2．4外周血清IL-4、IL-13和IL-12的ELISA法检测

2．5数据分析处理

3．结果与分析

3．2肺组织吉姆萨染色病理比较

3．3肺组织PCR凝胶电泳

3．4肺组织IL-4R、IL-13Rα1和IL-13Rα2mRNA水平及比较

3．5肺组织STAT-6凝胶电泳

3．6肺组织STAT-6水平比较

3．7外周血IL-4和IL-13水平比较

第三部分结果探讨

1．支气管哮喘大鼠模型评价

1．1实验动物选取

1．2造模方法评价

2．平哮颗粒对各组大鼠肺组织IL-4R、IL-13Rα1／α2mRNA的影响

2．2平哮颗粒对各组大鼠肺组织IL-13Rα1和IL-13Rα2mRNA的影响

2．3平哮颗粒对各组大鼠肺组织STAT-6的影响

2．4平哮颗粒对哮喘大鼠外周血IL-4和IL-13的影响

3．问题与展望

参考文献

附录

研究生期间取得成果

致谢