基于线粒体功能障碍探讨MUTYH及大黄附子汤在肾间质纤维化中的作用

摘要

目前，在世界范围内，慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)俨然成为了严重的公共卫生问题之一。流行病学调查显示，CKD在我国成年人群中的发病率已经高达10.8％。CKD临床主要表现为蛋白尿及肾功能的进行性减退，其发生发展机制与足细胞损伤导致的肾小球硬化，小管间质的纤维化等密切相关。因而，如何减轻肾脏小管间质的纤维化对于有效地延缓CKD的进展有着十分重要的意义。
　　近年来，关于线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction，MtD)在CKD疾病进展中的作用得到越来越多的揭示。实验表明，MtD可以导致氧化应激产物(reactive oxygen species，ROS)的产生增加，加重小管上皮细胞的凋亡。此外，他还能够通过促进肾小管上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)并且刺激转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β的释放等途径加重肾间质纤维化。所以，有效地保护线粒体功能对于减轻肾间质纤维化延缓CKD进展意义重大。
　　人MUTYH基因位于一号常染色体，大小约11.2Kb，其包括16个外显子，主要编码两种MUTYH蛋白:Ⅰ型蛋白质作用于线粒体DNA，Ⅱ型蛋白作用于细胞核DNA。MUTYH蛋白通过切除与8氧鸟嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)错配的腺嘌呤从而减少氧化应激导致的DNA G:C向A:T的突变，进而维持基因的稳定性。MUTYH基因功能的缺失和异常可以导致多种肿瘤以及神经系统疾病的产生，然而目前关于其在线粒体功能及肾间质纤维化中的作用尚不明了。
　　线粒体与中医学里的“气”在某些方面具备共通性:功能上，线粒体产生能量用以供应人体生命活动及维持人体体温，而气则能够起到推动及温煦的作用;病理变化上，线粒体病变可导致人体多个系统如肾脏、心脏、神经的病变，气的虚损及气机失调亦可引发多个脏腑器官的疾病。一些实验研究也证实，具备温阳作用的中医药如锁阳、姜黄等能够起到保护线粒体功能的作用。然而，作为温下剂代表方的大黄附子汤，其是否具有保护线粒体功能延缓肾脏间质纤维化的作用尚未见研究报道。
　　我们设想MUTYH能够通过减少氧化应激导致的DNA突变损伤，保护线粒体功能从而减轻肾间质纤维化延缓CKD的进展，大黄附子汤能够通过保护线粒体功能减轻肾间质纤维化从而保护肾脏。
　　第一部分 MUTYH基因的敲除加重小鼠UUO模型的间质纤维化及线粒体功能障碍
　　目的:在小鼠UUO模型中观察MUTYH基因敲除对于肾间质纤维化及线粒体功能的影响
　　方法:分别利用C57BL/6背景的野生型小鼠和MUTYH基因敲除型小鼠建立单侧输尿管梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型，各自分为对照组、UUO3d、UUO10d三组。模型建立成功后处死小鼠收割小鼠肾脏，利用Masson染色观察小鼠肾间质纤维化程度，qRT-PCR检测野生型小鼠UUO模型中MUTYH基因表达的变化，Westem blotting和qRT-PCR检测纤维化指标α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表达差异，qRT-PCR检测炎症指标白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule1，ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP-1)的表达，同时检测线粒体功能障碍指标线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数、线粒体膜电位(mitochondrial membrance potential，MMP)及氧化应激产物(reactive oxygenspecies，ROS)的变化。
　　结果:(1)在野生型小鼠UUO模型中，MUTYH基因的表达随着梗阻时间的延长而增高。(2) Masson染色显示，与对照组比较，UUO模型肾脏细胞外基质沉积显著增多，Western blotting和qRT-PCR检测发现α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表达增高，qRT-PCR检测结果显示炎症因子释放增多。与野生型UUO模型相比，MUTYH基因敲除使得细胞外基质沉积增多，α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表达增高及炎症因子的释放更为明显。(3)相较于对照组，UUO模型中mtDNA的拷贝数、MMP下降，ROS的产生增多，提示UUO模型中存在线粒体功能障碍，这一现象在MUTYH基因敲除的UUO模型中更为严重。
　　结论:MUTYH基因的敲除加重了UUO模型的肾间质纤维化及线粒体功能障碍。
　　第二部分过表达MUTYH减轻TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及线粒体功能障碍
　　目的:观察过表达MUTYH对于TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及线粒体功能障碍的作用
　　方法:利用永生的人肾脏(human kidney，HK-2)近端肾小管细胞进行培养，分为对照组，5ng/ml的TGF-β1刺激组，TGF-β1刺激加h-mutyh过表达组。Westernblotting和qRT-PCR观察TGF-β1分别刺激细胞24h、48h后MUTYH的表达，Western blotting和qRT-PCR检测纤维化指标α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表达，Elisa试剂盒检测8-oxoG的水平，同时观察线粒体功能障碍指标mtDNA拷贝数、MMP和ROS的变化。
　　结果:(1)加入TGF-β1刺激后，qRT-PCR检测发现MUTYH基因的表达随着刺激时间的延长而增多，Western blotting结果发现MUTYH编码的Ⅰ型线粒体蛋白(～57kDa)表达减少，而Ⅱ型核蛋白(～53kDa)的表达增多。(2)给予TGF-β1刺激后细胞纤维化指标α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表达较对照组增多，8-oxoG的水平增高，过表达h-mutyh可以抑制TGF-β1诱导产生的上述现象。(3)与对照组相比，TGF-β1刺激的HK-2细胞mtDNA拷贝数、MMP下降、ROS产生增多，提示TGF-β1刺激可导致HK-2细胞线粒体功能受损，而过表达h-mutyh可使得mtDNA拷贝数、MMP下降的程度减轻，ROS的产生减少。
　　结论:过表达MUTYH减轻TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及线粒体功能障碍。关键词:MUTYH;HK-2细胞;纤维化;线粒体功能障碍
　　第三部分大黄附子汤减轻慢性马兜铃酸肾病的间质纤维化及线粒体功能障碍
　　目的:观察大黄附子汤能否可以减轻慢性马兜铃酸肾病(aristolochic acidsnephropathy，AAN)的间质纤维化及马兜铃酸诱导的线粒体功能障碍
　　方法:雄性的C57BL/6小鼠随机分为六组:对照组、模型组、生理盐水治疗组，常规剂量大黄附子汤组、高剂量大黄附子汤组和罗格列酮治疗组，对照组小鼠给予每三天腹腔注射生理盐水，模型组给予连续8周每三天给予腹腔注射3mg/kg的马兜铃酸Ⅰ(Aristolochic acidsⅠ，AAⅠ)，4周后常规剂量组给予2.5mg/kg/d的大黄附子汤灌胃，而高剂量组给予5mg/kg/d的大黄附子汤灌胃治疗，罗格列酮组给予5mg/kg/d的罗格列酮灌胃治疗。实验结束时，收集小鼠24h尿液及血液标本，留取肾脏。检测小鼠一般指标如肾重、肾重/体重指数，肾功能指标如24h尿蛋白(24h urinary protein，24hUpro)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)的变化，Masson染色观察肾间质纤维化程度，Westem blotting检测肾间质纤维化指标collagenⅠ和collagenⅢ的表达，同时观察线粒体功能指标mtDNA拷贝数、MMP、ATP和ROS的变化。
　　结果:(1)与对照组比较，模型组小鼠的肾重、肾重/体重指数下降，24hUpro、BUN、Scr水平升高，给予常规剂量大黄附子汤治疗后上述指标改善不明显，而给予高剂量大黄附子汤及罗格列酮治疗的小鼠上述指标改善明显。(2) Masson染色显示，模型组肾间质纤维化程度较对照组严重，细胞外基质沉积显著增多，Western blotting也证实collagenⅠ、collagenⅢ的表达增高，高剂量大黄附子汤及罗格列酮治疗能够减轻细胞外基质沉积，降低collagenⅠ、collagenⅢ的高表达。(3)相较于对照组，模型组mtDNA、MMP、ATP下降程度明显，ROS产生明显增多，提示慢性AAN存在严重的线粒体功能障碍，给予高剂量大黄附子汤及罗格列酮治疗后，mtDNA、MMP、ATP的下降程度减轻，ROS的产生减少。
　　结论:大黄附子汤能够减轻慢性AAN的肾间质纤维化及马兜铃酸导致的线粒体功能障碍

目录

声明

摘要

引言

第一部分 MUTYH基因的敲除加重小鼠UUO模型的间质纤维化及线粒体功能障碍

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 过表达MUTYH减轻TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及线粒体功能障碍

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 大黄附子汤减轻慢性马兜铃酸肾病的间质纤维化及线粒体功能障碍

前言

材料与方法

结果

讨论

全文小结

特色与创新之处

参考文献

英文缩略词

综述 The Role of MUTYH，a DNA glycosylase，in chronic kidney disease

博士期间发表论文

致谢