猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆、表达及其重组蛋白ELISA诊断方法的建立

摘要

采用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的全长cDNA片断,并将其克隆到pMD-18T载体中进行测序,序列分析结果表面:ORF7基因cDNA编码区全长372bp,可编码123个氨基酸残基.将该cDNA片断克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST编码基因下游,构建了融合表达质粒pKGN.将pKGN转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析表明,pKGN在BL21(DE3)中获得高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约42kD;Western blot试验进一步证实该融合蛋白能与猪抗PRRS病毒高免血清发生特异性反应,表明该融合蛋白有良好的反应原性.经8M尿素变性,透析法复性提取包涵体,用所分离纯化的重组蛋白(GST-N)作抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征血清抗体的间接重组蛋白ELISA方法(rN-ELISA).该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性.与国外商品化IDEXX HerdCheck<'R> ELISA试剂盒平行检测127份血清样品,其总符合率为90.55﹪.

目录

Abbreviations缩写词

摘要

Abstract

文献综述猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1 PRRS发病历史

2病原学

2.1 PRRS病毒的分类地位及理化特性

2.2 PRRS病毒的分子生物学特性

3免疫学

3.1体液免疫

3.2细胞免疫

3.3 PRRS病毒感染对免疫系统影响的双重性

3.4持续感染

3.5疫苗免疫

4血清学诊断方法

4.1免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)

4.2间接免疫荧光试验(IFA)

4.3血清中和试验(SVN)

4.4酶联免疫吸附试验(ELISA)

5目的及意义

参考文献

0前言

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 ORF7基因的克隆与鉴定

2.2序列分析

2.3原核表达质粒的构建

2.4表达蛋白的SDS-PAGE检测与Western blot分析

2.5 rN-ELISA的方阵滴定结果

2.6 rN-ELISA方法的交叉反应性和重复性试验

2.7 rN-ELISA与国外试剂盒的对比试验

3讨论

3.1 RNA的提取

3.2 PCR产物的克隆

3.3序列分析

3.4 GST融合表达载体

3.5诱导表达

3.6包涵体的提取与复性

3.7 ELISA方法

4结论

参考文献

致谢