湿地松TPS基因同源克隆及其与产脂性状的关联分析

摘要

由于松脂市场供不应求，松脂性状的研究已成为热点问题，为了解产脂性状的分子遗传学基础，本研究利用已发表的松属萜稀合成酶(terpene synthases，TPS)基因的cDNA序列和火炬松基因组序列，同源克隆了湿地松的PeTPS-(+)Apin和PeTPS-(-)Apin基因，分析了其序列同源性，预测了其蛋白质结构和功能，并以之作为与产脂性状相关联的候选基因。通过对24个湿地松样品的DNA序列测序发现SNP位点，获得核苷酸多样性信息、中性进化信息和LD衰退水平，并筛选SNP位点。对111个湿地松家系的全年产脂量和生长性状测定，以除去生长因子的基础遗传力(W(0))、包括生长因子在内的潜在遗传力(Wp)和实测年总产脂量（W)作为表型性状，利用关联分析鉴定了相关的功能SNP或单体型。主要成果如下:
　　(1)克隆的湿地松TPS基因分子量为71.77-78.46ku，带弱正电，为不稳定蛋白，易分解，含37-39个磷酸化位点，定位在叶绿体。蛋白质二级结构含有2-7个不规则卷曲，24-25个α-螺旋，三级结构中含有一个cd00684保守域。在氨基酸序列的65-69位出现NDR切割位点，猜测该保守结构能够在第二个R的N末端断裂并与底物结合，从而参与底物异构化。预测的两个磷酸化位点分别位于287-302位和579-623位氨基酸。
　　(2) PeTPS-(+)Apin基因全长3175bp，核酸多样性（π）为0.00380，核酸多样性(θw)为0.00354，处于中等偏低水平，核苷酸序列具有很强的保守性。该基因正在经历平衡选择的作用，在进化上遵循中性模型，LD水平较低，r2值在100bp左右就下降到0.2以下，需要较大密度的标记。29个高信息量SNP位点中，仅有GT1131和CT2096位点对基础产脂力（W0)有微弱关联（P≤0.1），解释效应分别为0.15％和0.068％。该基因能够解释表型变异的0.218％，但有可能是假关联，认为该基因与产脂性状关系不大。
　　(3) PeTPS-(-)Apin基因全长4628bp，核酸多样性（π）为0.00277，核酸多样性(θw)为0.00260，处于较低水平，核苷酸序列具有很强的保守性。该基因正在经历平衡选择的作用，在进化上遵循中性模型，LD水平较高，r2值在2000bp左右下降到0.2以下，且在全部4000bp长度上再没有明显下降，标记之间存在紧密连锁。5个单体型块中，(-)Apin-2单体型与三个产脂性状均有显著相关，解释效应分别为2.860％、2.901％和2.860％，(-)Apin-3和(-)Apin-4单体型与基础产脂力（W0)有显著相关，解释效应分别为1.748％和1.097％。该基因可以解释2.86％W和Wp的表型变异和5.746％W0的表型变异，是与产脂性状相关联的合适的候选基因。

目录

论文说明

声明

摘要

1 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 湿地松及松脂概况

1．1．2 本研究的目的和意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 针叶树产脂机理的研究

1．2．2 松树基因组的研究

1．2．3 分子标记及关联分析

1．3 研究内容与技术路线

1．3．1 研究内容

1．3．2 技术路线

2 候选基因的同源克隆及生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验地概况

2．1．2 引物设计

2．1．3 基因组DNA的提取与PCR扩增

2．1．4 主要试剂与仪器设备

2．1．5 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 DNA提取与PCR扩增

2．2．2 序列同源性分析

2．2．3 蛋白质理化性质分析

2．2．4 蛋白质结构分析

2．2．5 蛋白质功能分析

2．2．6 TPS基因进化树的构建

2．3 小结

3 SNP位点筛选与多样性分析

3．1 材料与方法

3．1．1 样品材料和引物设计

3．1．2 基因组DNA的提取与PCR扩增

3．1．3 主要试剂与仪器设备

3．1．4 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 候选基因序列分析及SNP位点筛选

3．2．2 核苷酸多样性分析

3．2．3 选择中性检测

3．2．4 连锁不平衡分析

3．3 小结

4 基因型分型与关联分析

4．1 材料与方法

4．1．1 产脂量的测定

4．1．2 样品采集与基因型分型

4．1．3 主要试剂与仪器设备

4．1．4 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 产脂性状表型变异

4．2．2 PeTPS-(+)Apin基因SNP位点分型

4．2．3 PeTPS-(-)Apin基因单体型分型

4．2．4 PeTPS-(+)Apin基因与性状的关联分析

4．2．5 PeTPS-(-)Apin基因与性状的关联分析

4．3 小结

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 湿地松TPS结构和功能分析

5．2．2 湿地松DNA提取方法的探讨

5．2．3 候选基因的选择

5．2．4 湿地松分子水平的初步分析

5．3 展望

5．3．1 火炬松全基因组序列的公开可直接用于其他松属植物

5．3．2 获得更适合的候选基因和关联群体是进一步的研究方向

参考文献

致谢