镉升高[Ca]介导CaMKⅡ磷酸化激活MAPKs和mTOR通路诱导神经细胞凋亡分子机理

摘要

本文运用细胞培养、流式细胞仪、Western bloting等细胞学分子生物学技术,系统研究了镉诱发神经细胞凋亡过程中,胞内游离钙离子变化和CaMKⅡ磷酸化状态及其对MAPK和mTOR信号转导通路的影响。探讨了Ca2+在镉致神经细胞凋亡中的调控作用及[Ca2+]I升高机制,以及CaMKⅡ在镉上调胞内Ca2+信号引发神经细胞凋亡过程中信号转导分子机制。结果如下:
　　 1、镉触发神经细胞[Ca2+]I升高涉及MAPKs和mTOR通路激活和凋亡
　　 以PC12和原代神经元为对象,实验分组如下:对照组(PBS对照)和三个镉处理组分别为5、10和20μMCdCl2;培养4 h和24 h后选用荧光探针Fluo-3/AM通过流式细胞仪分析细胞内Ca2+荧光强度。暴露于0-120μM CdCl2的PC12细胞,24 h后,MTT分析细胞活性;或4 h后采用Western Blotting技术分析细胞MAPK和mTOR信号蛋白变化。为进一步论证胞内钙离子是否参与镉诱发的神经细胞凋亡,PC12及原代神经元在BAPTA/AM预处理1h后,暴露10和20μM CdCl24 h或24 h,然后评价其保护效应,并分析BAPTA/AM对镉诱导神经细胞凋亡过程中MAPK和mTOR信号通路的影响。结果表明:镉以浓度依赖的方式触发[Ca2+]I升高诱发神经细胞凋亡,并关联着Erk1/2、JNK、p38 MAPK和mTOR通路激活。用胞内钙螯合剂BAPTA/AM预处理1 h可以通过阻滞Erk1/2、JNK、D38 MAPK和mTOR通路激活,且明显削弱镉诱导的PC12细胞凋亡。提示:镉触发神经细胞[Ca2+]I升高涉及MAPKs和mTOR通路激活和凋亡。
　　 2、镉诱导[Ca2+]I升高机理及与激活MAPKs和mTOR通路诱导神经细胞凋亡关系研究
　　 利用内质网上IP3受体的特异性抑制剂2-APB来研究IP3受体是否介导了镉诱导的胞内游离钙升高。PC12细胞接种于6孔或96孔培养板中,在10和20μM镉单独作用下及与2-APB(100μM)联合作用下,处理4或24 h,2-APB在加药前1 h加入。分别采用MTT法分析细胞活力,荧光测定法分析2-APB抑制IP3钙释放通道后对[Ca2+]I的影响并结合形态学拍照观察其对镉诱发的神经细胞凋亡的保护作用:同时利用Western Blotting方法检测2-APB阻断胞内钙库释放后,对神经细胞凋亡过程MAPK和mTOR信号蛋白的影响。结果表明:2-APB可以明显降低镉诱发的[Ca2+]I水平,通过阻滞Erk1/2、JNK、p38 MAPK和mTOR通路激活,能够抑制镉诱导的PC12细胞凋亡。提示:内质网上IP3R激活,钙释放通道的打开可能是镉引发[Ca2+]I升高的重要机制,2-APB对神经细胞死亡有明显保护作用。
　　 3、镉通过[Ca2+]I升高介导CaMKⅡ磷酸化激活MAPKs和mTOR通路诱导神经细胞凋亡
　　 PC12细胞随机分为阴性对照组和不同镉剂量(2.5μM,5μM,10μM,20μM)处理组,或者阴性对照组和20μCdC12不同时间(1h,2h,4h,8h,12h)梯度处理组来研究镉对PC12中CaMKⅡ信号分子的表达的影响,试图找出镉与CaMKⅡ表达的浓度和时间效应关系。此外,用BAPTA/AM和2-APB降低胞内镉诱导的游离钙水平,来分析CaMKⅡ的激活与上游Ca2+上游Ca2+信号的相关性。为了进一步验证CaMKⅡ介导了镉诱发的神经细胞凋亡,我们选用一种CaMKs的抑制剂KN93(10μM),将细胞随机分为对照组、10μM和20μMCdC12单独处理组及与KN93联合处理组进行实验。采用MTT法和形态学拍照分析KN93对神经细胞的保护作用,并结合Western Blotting技术分析神经细胞内CaMKⅡ对MAPK和mTOR信号通路上关键信号分子的调控。结果表明:镉致神经细胞凋亡中,CaMKⅡ表现出浓度和时间依赖性地激活,并且在20μMCdC12作用12h时,CaMKⅡ表达量最高。在BAPTA/AM和2-APB存在时,CaMKⅡ随之表达降低。用KN93预处理细胞1 h可以通过阻滞Erk1/2、JNK、p38 MAPK和mTOR通路激活明显抑制镉诱导的PC12细胞凋亡。提示:镉引发胞内游离钙[Ca2+]I升高可以进一步促进CaMKⅡ的磷酸化,介导MAPK和mTOR信号通路的活化最终导致神经细胞凋亡。钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ抑制剂如KN93对神经细胞死亡有明显保护作用。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 文献综述

第一章 镉对神经系统的影响及致细胞凋亡机制的研究进展

1 镉对神经系统的影响

2 镉致神经损伤的机制

3 镉致神经细胞凋亡的信号转导机制

参考文献

第二章 钙离子的生物学功能及其与神经变性疾病的关系

1 神经细胞内中的钙稳态

2 胞内钙离子失衡与神经变性疾病的关系

3 胞内Ca2+信号与MAKPs及mTOR信号通路的相关性

参考文献

第三章 Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ在神经细胞中的调控

1 CaMKⅡ的分子结构

2 CaMKⅡ的活性调节

3 CaMKⅡ的生物学功能

4 CaMK对细胞生长的调控作用

参考文献

第二部分 实验研究

第四章 镉触发神经细胞[Ca2+]i升高涉及MAPKs和mTOR通路激活和凋亡

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

Abstract

第五章 镉诱导[Ca2+]i升高机理及与激MAPKs和mTOR通路诱导神经细胞凋亡关系研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

参考文献

Abstract

第六章 镉通过[Ca2+]i升高介导CaMK]Ⅱ磷酸化激活MAPKs和mTOR通路诱导神经细胞凋亡

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Abstract

第三部分 全文结论

致谢

附1 攻读硕士学位期间发表交流的论文