三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定、检测及防控研究

摘要

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)又称梭子蟹、枪蟹、海螃蟹,隶属甲壳纲(Crustacea),十足目(decapoda),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹属(Portunus),在我国主要集中于山东和江浙沿海海域,是一种食用与药用价值较高的大型海产经济蟹类。然而近年来海洋环境受到污染,生态环境不断恶化,随着梭子蟹的养殖规模的逐渐增大,各种病害开始接踵而来,并呈现大规模暴发和流行的趋势,特别是细菌性疾病,给三疣梭子蟹养殖业造成了严重的经济损失。为了进一步弄清导致养殖梭子蟹死亡的病因及其致病机理,并找到有效的检测手段和防治方法,本文以具有典型病症的病蟹作为材料,通过对病原的分离鉴定、人工回感试验、组织病理观察并结合常规的生理生化反应特性及分子生物学特性,对梭子蟹的病原进行了初步研究；同时建立了病原菌的分子生物学检测方法,筛选了防治药物,以期为梭子蟹细菌性疾病的早期诊断及防治提供科学的参考依据。
　　 2009～2010年在江苏省连云港市赣榆等地养殖的梭子蟹出现大量死亡,病蟹主要症状为蟹体消瘦,不摄食、行动缓慢,严重者浮出水面或爬在池边,对外界的刺激反应迟钝；掀开头胸甲可见肝胰腺、肌肉组织水肿,并有大量浑浊的积液,严重者肌肉糜烂并伴有腐臭的气味。从濒死的梭子蟹体内无菌操作分离得到两株优势菌。人工感染试验表明所分离的菌株JG091120-1对三疣梭子蟹、日本蟳(Charybdis japonica)、中国对虾(Penaeus chinensis)均有明显的致病作用,而另一株菌JG091120-2无致病作用,由此表明菌JG091120-1为本次梭子蟹的致病菌。通过菌体观察、培养特性及生理生化鉴定并结合系统发育学等分子手段,鉴定该菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性,需氧或兼性厌氧,为条件致病菌,广泛分布于自然界中,是人和动物(哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。该菌可导致河蟹、乌鳢、红螯螯虾、尼罗罗非鱼等水产动物暴发疾病。药物敏感性试验结果表明,该致病菌对氟罗沙星、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7种抗生素高度敏感。
　　 运用石蜡包埋及组织切片技术对患病梭子蟹的鳃、肝胰腺、螯足肌肉、肠道、心肌等组织进行了病理学研究,同时对其致病机理进行了初步分析。其病症主要表现为:肌细胞破损、坏死,部分细胞细胞核出现萎缩或肿胀,血细胞凝集,肝胰腺细胞严重坏死。
　　 进行了病原弗氏柠檬酸杆菌防治药物的筛选工作,选择市场中常用渔用抗生素及中草药进行药敏试验,结果表明抑菌净、恩诺沙星、氟哌酸、复方磺胺甲噁唑、苏木、五倍子、五味子、大黄、黄柏、黄连等抗菌效果十分显著。
　　 本论文基于定居因子抗原cfa基因序列设计了1对引物,建立了一种弗氏柠檬酸杆菌快速、准确的PCR检测方法,敏感性检测结果显示,该PCR方法最低能检测6.47×103CFU/mL菌体浓度的弗氏柠檬酸杆菌,对其菌体模板DNA的检出极限为0.1468ng/μL；采用此方法对发病梭子蟹、中国对虾,泥蚶(Tegillarca granosa)、扇贝(Placopecta magellanicus)等海产品和养殖水体进行了检测,可从呈阳性反应的样品中分离出优势生长的弗氏柠檬酸杆菌,因此,实验所建立的基于cfa基因的PCR检测方法可用于弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物疾病的快速诊断。