草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要品种之一。长期以来，草鱼出血病(hemorrhagic disease of glass carp)发病率较高，死亡率高达80％以上，草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)已被证实为草鱼出血病的病原。
　　GCRV隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)，是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。GCRV主要侵染于草鱼肝脏、心脏、肌肉、肾脏、脾、鳃、肠道等活的组织细胞内，导致化学药物难于达到治疗效果，已成为草鱼养殖发展中的“瓶颈”问题。GCR-V不仅感染草鱼，而且还感染青鱼、麦穗鱼以及某些海水鱼等养殖鱼类，对淡水养殖业造成了严重的危害。
　　GCRV为立体对称的20面体球形颗粒，由RNA核心和多层衣壳(内壳层、中间层与外壳层)组成，其基因组为11条分节段的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)。近几年，基因序列分析和三维结构研究表明，成熟的GCRV颗粒由7种衣壳蛋白(VP1～VP7)组成，其中VP5和VP7为病毒外衣壳组分，VP7蛋白是由GCRV第10片段编码，已被揭示其在病毒感染及致病过程中起着不可替代的作用，并且具有较好的抗原性。VP5和VP7抗体都能与抗原中和，且VP7的抗体中和活性是VP5的3倍，表明VP7可能是GCRV主要的抗原决定簇，含有VP7基因的重组质粒又可成功转染到真核细胞中，使研制GCRV基因疫苗成为可能。
　　核酸疫苗，又称基因疫苗或DNA疫苗，是通过基因工程改造的DNA注入机体后产生免疫应答来防治疾病一种新型疫苗。具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，大大克服了灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等所存在的缺陷，已引起行业内的广泛关注。
　　将团头鲂(Megalobrama amblycephala)的β-肌动蛋白启动子控制的VP7基因克隆进杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中，同时将另一拷贝的VP7基因置于杆状病毒多角体蛋白(polh)基因启动子控制之下，构建VP7基因核酸疫苗表达载体pFastBac-β-VP71-VP72。初步开展了核酸疫苗的免疫效果以及对草鱼出血病的免疫保护实验。实验设三个重组基因疫苗pFastBac-β-VP71-VP72剂量组，注射剂量分别为10μg、30μg、60μg，空载体组注射pFastBacTMDual30μg，对照组不注射任何疫苗。免疫后第14、21、28、49、70天对草鱼进行尾静脉取血，通过RT-PCR检测核酸疫苗的体内转录情况，间接凝集反应测定抗体水平，第21天攻毒试验来检测各组的免疫保护效果。结果显示，重组质粒pFastBac-β-VP71-VP72导入鱼体后，VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达，至第49天仍能检测到目的基因的转录。各免疫组均有抗体产生，抗体效价在第21天检测时达到最高，30μg剂量组略高于其它剂量组；攻毒试验计算注射疫苗各组死亡率分别为0％、0％和5％，空载体组和对照组分别为30％和100％。
　　实验结果表明，构建的pFastBac-β-VP71-VP72草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗具有较好的免疫作用和免疫保护效率，为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的生产应用和产业化提供了一定的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 草鱼出血病的流行病学和病原研究

1.2 草鱼呼肠孤病毒的研究进展

1.2.1 病毒结构研究

1.2.2 理化特性和感染特性研究

1.2.3 病毒蛋白及免疫性研究

1.2.4 病毒的检测

1.3 草鱼出血病免疫防治研究进展

1.3.1 环境对草鱼免疫防治的影响

1.3.2 干扰素的免疫调节功能

1.3.3 免疫增强剂的应用

1.3.4 疫苗防治研究

1.4 核酸疫苗的研究与应用

1.4.1 核酸疫苗的构建与作用机理

1.4.2 核酸疫苗的优点与存在的问题

1.4.3 核酸疫苗在鱼类免疫中的应用

1.5 研究目的与实验设计

第2章 目的基因VP7的扩增、克隆与鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 VP7基因的扩增

2.2.2 VP7基因的T载体克隆与鉴定

2.3 实验结果

2.3.1 VP7基因的扩增结果

2.3.2 VP7基因的T载体克隆及测序结果

2.4 讨论

第3章 目的蛋白VP7免疫原性的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 VP7基因自pET-28a(+)载体克隆与鉴定

3.2.2 VP7蛋白的诱导表达

3.2.3 VP7蛋白的SDS-PAGE及Western Blot分析

3.3 实验结果

3.3.1 重组载体pET-VP7鉴定结果

3.3.2 SDS-PAGE及Western Blot分析结果

3.4 讨论

第4章 目的基因VP7核酸疫苗的构建

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 β-肌动蛋白启动子的扩增与克隆

4.2.2 VP7双基因的克隆

4.3 实验结果

4.3.1 β-肌动蛋白启动子的扩增与克隆结果

4.3.2 VP7双基因的克隆结果

4.4 讨论

第5章 核酸疫苗的免疫效果研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 重组质粒与实验鱼的处理

5.2.2 RT-PCR检测核酸疫苗的转录

5.2.3 抗体水平的测定

5.2.4 攻毒用毒株的LD50测定

5.2.5 人工感染试验

5.3 实验结果

5.3.1 RT-PCR检测核酸疫苗的转录结果

5.3.2 抗体水平的测定

5.3.3 LD50测定结果

5.3.4 死亡率和免疫保护力

5.4 讨论

参考文献

附录：读研期间科研成果

致谢