粟酒裂殖酵母线粒体tRNA3'末端加工酶基因sptrz2+温度敏感型菌株的筛选与加标签研究

摘要

tRNA(transfer ribonucleic acid)3’端加工成熟过程，是指剪切掉tRNA前体3’端的多余碱基序列以及在其末端添加CCA的过程。只有加工成熟后的并带有3’CCA末端的tRNA才能进行氨基酰化，执行其在蛋白合成过程中的功能。真核生物、古生菌和一些细菌的tRNA基因不编码3’末端CCA，其CCA需要在tRNA3’末端加工成熟后再添加上去，这类tRNA的3’末端的加工成熟需要核酸内切酶tRNase Z参与。
　　粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce pombe中含有两种tRNase Z基因：sptrz1+(SPAC1D4.10)和sptrz2+(SPBC3D6.03c)，它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中。本实验组已经证实两种tRNasez都是必需基因。我们已经完成了对sptrz1+的功能的相关研究，本实验的主要内容是得到一株sptrz2+的温度敏感型突变菌株，并利用该菌株进行SpTrz2p功能的相关研究。
　　据冷泉港实验室Danielle V.报道sptrz2-A623V的突变会使菌株产生温度敏感的表型。本实验中把sptrz2-A623V突变引入到遗传背景比较清楚的菌株S.pombeyAS56中的，得到具有温度敏感型的菌株tsD。根据对tsD中sptrz2-A623V的基因型进行测序鉴定以及带有sptrz2+的外源质粒限制性温度下救活实验的结果，因此确认tsD即为sptrz2+的温度敏感型菌株，可以用于对SpTrz2p相关功能的进一步研究。
　　本课题组也对温敏菌株SpTrz2p的C端进行加标签实验，选择了三种标签：HA、3HA、GFP，从而可以利用western技术跟踪测定细胞内SpTrz2p的表达量。得出温度敏感型菌株产生的原因，但是在实验过程中发现标签对Sptrz2p功能有影响：HA、3HA对蛋白功能的影响较GFP严重。成功的给野生型S.pombeyAS56的Sptrz2p加上了GFP标签，但无法给温度敏感型菌株加上标签，进而采用重组蛋白的方法制备Sptrz2p的抗体。

目录

文摘

英文文摘

第1章 综述

1.1 TRNA的结构和功能研究

1.1.1 tRNA的结构

1.1.2 tRNA的类型

1.2 TRNA的加工机制

1.2.1 原核生物tRNA前体3'末端的加工

1.2.2 真核生物tRNA前体3'末端的加工

1.3 TRNA功能

1.4 粟酒裂殖酵母

1.5 粟酒裂殖酵母必需基因的研究方法

1.6 遗传学方法筛选抑制基因

1.7 GFP研究进展

1.8 展望

第2章 SPTRZ2韫度敏感型突变体的筛选

2.1 材料与培养基

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂及储存液

2.2 实验方法

2.2.1 Sal Ⅰ/Sma Ⅰ双酶切质粒pBS Ⅱ K-sptrz2(A623V)-kanMX6

2.2.2 线性化载体pBS Ⅱ K-sptrz2(A623V)-kanMX6转化yAS56

2.2.2 转化子的纯化培养

2.2.4 转化子的影印及温敏筛选

2.2.5 tsD四株温敏菌表型初步验证

2.2.6 菌种保藏

2.3 实验结果及分析

2.3.1 pBSⅡK-sptrz2(A623V)-kanMX6线性化结果

2.3.2 影印及温敏筛选结果

2.3.3 tsD温敏表型初步验证结果

2.4 讨论

第3章 SPTRZ2-A623V温度敏感型鉴定以及功能互补实验

3.1 实验材料

3.1.1 菌种和质粒

3.1.2 培养基

3.1.3 主要试剂及耗材

3.1.4 引物

3.2 实验方法

3.2.1 温度梯度以及富集培养基和基础培养基划线鉴别tsD4的温敏表型

3.2.2 限制性温度下Pwh5-Sptrz2对tsD4的救活作用

3.2.3 重叠延伸PCR技术介绍

3.2.4 质粒的构建

3.3 实验结果及分析

3.3.1 验证tsD4在不同温度梯度以及不同培养基上的温敏表型

3.3.2 Pwh5-sptrz2对tsD4的救活实验

3.3.3 pREP3x-Sctrz1：pREP41x-Sctrz1；pREP81x-Sctrz1质粒的构建

3.3.4 质粒pREP3X-flag-ELAC2；pREP41X-flag-ELAC2；pREP81X-flag-ELAC2构建

3.3.5 质粒pREP81X-SpTrz2 N-ScTRZ1、pREP41X-SpTrz2N-ScTRZ1C和pREP3X-SpTrz2N-ScTRZ1C的构建

3.3.6 将上述质粒转化入温度敏感型菌株tsD4中

3.4 讨论

第4章 标签对SPTRZ2P体内功能的影响

4.1 材料与培养基

4.1.1 材料

4.1.2 培养基

4.1.3 引物

4.1.4 琼脂糖凝胶电泳

4.2 实验方法

4.2.1 质粒的构建

4.2.2 将pdh3、pdh4、pdh6和pYY15通过醋酸锂法转化入酵母细胞

4.2.3 将pdh10、pdh11通过醋酸锂法分别转化入yAS56和yGW1酵母细胞

4.2.4 质粒pet28a-SpTrz2的构建

4.3 实验结果

4.3.1 质粒PF6A-3HA-Kamx-trz2down和PF6A-Trz2-3HA-Kamx-trz2down的构建

4.3.2 质粒pREP81x-Trz2-3HA和pREP81x-Trz2-HA的构建

4.3.3 质粒pREP81x-SpWz2-GFP的构建

4.3.4 质粒pdh10和pdh11的构建

4.3.5 不同标签对SpTrz2p的影响

4.3.6 不同表达量的GFP标签对SpTrz2p的影响

4.3.7 GFP标签整合到酵母基因组内的PCR验证

4.3.8 GFP标签整合到酵母基因组内的克隆验证

4.3.9 质粒pet28a-SPTrz2的构建

4.4 讨论

参考文献

附录

附录一 主要仪器

附录二 本实验所用的质

附录三 本实验所用的菌种

致谢