染料及药物小分子与人类端粒DNA相互作用的研究

摘要

小分子和DNA的结合模式与DNA自身的转录和复制密切相关，对它们之间结合模式的研究能够进一步阐明DNA的结构与功能的关系，以及抗癌、抗病毒、抗肿瘤药物的作用机理和理解某些常见疾病的发病机理等。
　　本论文以分析速度快、方法简便、成本低、设备简单、样品需求量少的电化学分析方法为基础，结合光谱法详细研究了具有氧化还原性质的染料及药物小分子与人类端粒双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)的结合模式和作用力的识别，并讨论了它们之间差异性作用的模式和机理。本文结合染料及药物分子的电化学特性以及石墨烯优良的导电性能，首次制备了茜素/石墨烯-壳聚糖(AR/GR-CS/GC)电极及竹红菌甲素/石墨烯(HA-GR/GC)电极。与裸电极相比较，该修饰电极能够高效、特异性结合端粒DNA分子，还具有性质稳定、电化学信号明显等优点。利用上述修饰电极不仅对染料及药物小分子与端粒DNA的作用机制进行了探讨，还用于了人体血样及腹液中端粒DNA含量的检测，且检测结果令人满意。本课题研究内容和结论如下:
　　1.利用电化学结合光谱的方法研究了邻苯二酚紫(Pyrocatechol violet，PCV)与端粒DNA在生理条件下的相互作用，结果表明，PCV和端粒DNA的结合模式为嵌插模式。基于伏安滴定实验求得PCV与端粒DNA的结合常数和结合位点数分别为5.3×109 mol·L-1和1.7。在最优的实验条件下，根据PCV还原峰电流变化量与端粒DNA浓度的变化关系可以测得溶液中端粒DNA的含量，当端粒DNA的浓度在0.2-13.0μmol·L-1范围内，线性回归方程为⊿Ⅰpa(μA)=0.075CDNA(μmol·L-1)-0.041，R2=0.9922，检测限为0.1μmol·L-1，且该检测方法的抗干扰性较好，为定量检测端粒DNA提供了一个简便、快速的分析方法。
　　2.应用茜素(Alizarin，AR)掺杂石墨烯(GR)、壳聚糖(CS)首次制备了AR/GR-CS电极，该修饰电极在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中出现了一对可逆的氧化还原峰，AR的氧化峰的峰电位位于-0.573 V，还原峰的峰电位位于-0.652V。循环伏安法（CV)证明AR在电极上发生了两电子两质子的氧化还原过程，并且标准速率常数Ks为1.69 s-1。基于AR与端粒DNA相互作用后而导致的AR还原峰电流减弱及式量电位(E0）负移等电化学信号的变化，建立起了一种快速灵敏、重现性好、操作简单的测定人类端粒DNA的电化学分析方法，此方法的线性响应范围为8×10-8 mol·L-1～1.4×10-5mol·L-1，线性拟合方程为⊿Ⅰpc(μ A)=8.4860+0.5366CDNA(μmol·L-1)，R2=0.9990，最低检测限为2×10-8 mol·L-1(S/N=3)，该方法可对生物样品直接测定，无需添加试剂及预处理样品。有望用于实际样品的测定。
　　3.将石墨烯(Graphene，GR)掺杂竹红菌甲素(Hypocrellin A，HA)按照一定的体积比混合得到GR-HA混合液，运用透射电镜(TEM)和傅里叶红外光谱(FTIR)对混合液进行表征，得知GR与HA的主要作用力为π-π堆积效应和氢键作用。循环伏安法(CV)和示差脉冲伏安法(DPV)测量是在pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液中进行。荧光实验证明了HA对EB-DNA体系能够产生荧光猝灭现象，且猝灭过程为动态猝灭。基于荧光变温实验，分别计算出了HA和端粒DNA在293 K和308 K时的结合位点数为1.04和0.89。在常温下，HA与DNA反应后的电子转移系数(α)为0.64，标准速率常数（Ks）为1.28×10-2 s-1。热力学实验证明了两者之间的作用力主要是氢键和范德华力。当溶液中端粒DNA的浓度在5.91×10-9～7.27×10-7 mol· L-1的范围内，HA氧化峰电流的变化量与端粒DNA的浓度成良好的线性关系，线性回归方程为△Ⅰpa(10-5A)=19.67CDNA(10-8mol·L-1)-2.98×10-5，R2=0.9922，检测限为1.21×10-10mol·L-1(S/N=3)。将该修饰电极用于人类血清和腹液中端粒DNA的测量，结果令人满意。标准加入法测得样品的回收率为99.54％～103.21％。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 DNA属性及其与染料及药物小分子的相互作用

1．2．1 DNA的组成和结构

1．2．2 DNA的物理性质

1．2．3 DNA与染料及药物小分子的作用模式

1．3 与DNA作用的小分子的分类

1．3．1 邻苯二酚紫的物理性质及用途

1．3．2 茜素的物理性质及用途

1．3．3 竹红菌甲素的物理性质及用途

1．4 染料及药物分子与DNA相互作用的研究进展

1．5 小分子和DNA之间相互作用的研究方法

1．5．1 光谱法

1．5．2 电化学法

1．5．3 模拟计算法

1．5．4 其他分析技术

1．6 本课题的基本思路和目的

第2章 光谱及电化学方法研究邻苯二酚紫(PCV)与人类端粒DNA的相互作用

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器和试剂

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 紫外-可见吸收光谱

2．3．2 热力学实验

2．3．3 热力学参数和作用力的判断

2．3．4 热变性实验

2．3．5 荧光实验

2．4 PCV与端粒DNA的电化学实验

2．4．1 循环伏安法

2．4．2 PCV与端粒DNA单双链的相互作用

2．4．3 结合常数和结合位点

2．4．4 离子强度对PCV与端粒DNA相互作用的影响

2．4．5 标准曲线和检测线

2．4．6 干扰物质的影响

2．5．小结

第3章 光谱和电化学方法研究茜素(AR)与人类端粒DNA的相互作用

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器和试剂

3．2．2 端粒DNA溶液的配制方法

3．2．3 CS溶液的配制

3．2．4 GR-CS悬浮液的配制

3．2．5 AR-GR-CS悬浮液的配制

3．2．6 修饰电极的制备

3．2．7 电解液浓度、修饰剂用量及富集时间的优化

3．2．8 电化学测量

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验原理

3．3．2 GR-CS悬浮液及AR-GR-CS悬浮液的形貌表征

3．3．3 紫外-可见吸收光谱

3．3．4 结合常数和结合作用力的计算

3．3．5 AR与端粒DNA的结合位点数

3．3．6 修饰电极的电化学表征

3．3．7 AR在GR-CS／GC电极上的电化学行为

3．3．8 溶液pH值对AR／GR-CS／GC电极的影响

3．3．9 扫速对AR／GR-CS／GC电极的影响

3．3．10 AR／GR-CS／GC电极对端粒DNA的电化学响应及其检测

3．3．11 修饰电极的稳定性、重现性及抗千扰性实验

3．4 小结

第4章 竹红菌甲素(HA)与人类端粒DNA的光谱和电化学方法研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂及仪器

4．2．2 端粒DNA双链溶液和缓冲液的配制

4．2．3 HA修饰电极的制备

4．2．4 电化学测量

4．3 结果与讨论

4．3．1 GR分散液和GR-HA混合液的TEM表征

4．3．2 GR分散液和GR-HA混合液的FTIR表征

4．3．3 荧光猝灭实验

4．3．4 结合常数和结合位点数的计算

4．3．5 热力学参数的计算

4．3．6 修饰电极的电化学表征

4．3．7 溶液pH值对HA-GR／GC电极的影响

4．3．8 扫速对HA-GR／GC电极的影响

4．3．9 HA-GR／GC电极对端粒DNA的电化学响应及其检测

4．3．10 端粒DNA在HA-GR／GC电极上的电化学参数

4．3．11 HA-GR／GC电极检测端粒DNA的标准曲线及检测线

4．3．12 HA-GR／GC电极的稳定性、重现性及抗干扰性实验

4．3．13 实际样品的检测

4．4 小结

参考文献

攻读硕士期间的主要科研成果

致谢