小鼠心肌Hsp25基因缺失致心肌梗死后心脏破裂的机制研究

摘要

背景和目的 小分子热休克蛋白作为一类在进化上高度保守的蛋白，其在哺乳动物中生物学作用的重要性早已引起广泛关注。该家族中的Hsp25（鼠源）分子量为25kDa;而其人源的同源蛋白为Hsp27，分子量为27kDa。研究表明，Hsp25/Hsp27与心血管疾病发生发展之间存在重要关系。本课题组以往研究表明，过表达Hsp27能减轻急性心肌缺血/再灌注损伤，缩小心肌梗死面积，提示Hsp25/Hsp27具有潜在的心脏保护功能。但是Hsp25/27对心肌梗塞后的心肌重塑、中长期存活率的影响，都不清楚。因此，本课题组前期在构建Hsp25心肌特异性敲除小鼠基础上，发现Hsp25基因缺失显著增加心肌梗塞小鼠的死亡率，其死亡原因主要是心脏破裂。本实验将从细胞外基质重塑的角度，探讨Hsp25基因对心梗后心肌间质重塑的影响，以期为揭示Hsp25对心梗后疤痕修复的调节作用提供理论依据。 实验方法 1动物模型:本实验室通过与南京大学模式动物研究所合作构建了Hsp25基因心肌特异性敲除小鼠(Hsp25 knockout mice，Hsp25 KO)，饲养在南京大学模式所的无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)动物房中。对照组为具有同样背景的野生型小鼠(Wild Type，WT) 2小鼠基因型的鉴定: 1)用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)确定小鼠的基因型; 2)用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠心肌中Hsp25的蛋白表达水平。 3小鼠心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)模型的构建:戊巴比妥纳麻醉小鼠后，取仰卧位，呼吸机机械通气。备皮、开胸、暴露出心脏，撕开心包膜，在冠状动脉左前降支三分之一处进行永久性结扎，关胸，缝皮，30min之后撤下呼吸机，让小鼠自然苏醒。 4心功能评价:分别对假手术(sham)、MI后1天、3天的KO小鼠和WT小鼠进行异氟烷气体麻醉，取仰卧位，使用超声心动图测定心脏多项心功能指标，包括左心室射血分数(EF％)、心室短轴缩短率(FS％)、舒张期左室内径(LVIDd)、收缩期左室内径(LVIDs)等。 5小鼠心脏组织分区分离:断颈处死小鼠，迅速开胸，将心脏取出置于4℃的PBS中，首先截取结扎线以上的组织为梗死远端区(Infarct remote left ventricle; Infarctremote LV);剩下的组织按照梗死界限进行分离，梗死的区域称为（Infarct leftventricle; Infarct LV）;另一部分组织称为梗死周围区(Infarct border left ventricle;Infarct border LV)。 6细胞外基质的胶原检测:将梗死区的心肌置于戊二醛固定，送至南京医科大学电镜室进行制片，透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)观察心脏组织超微结构变化。 7统计学方法:使用SPSS17.0进行数据处理。数据以均数±标准差（(x)±s）表示，两组数据之间的比较用两样本均数检验（t检验），多组数据之间的比较用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。 实验结果 1 WT鼠心肌梗死后，其心肌中的Hsp25蛋白表达量会随着时间的延长而逐渐上调。 2构建Hsp25心肌特异敲除的小鼠模型，其野生型(WT)小鼠的心肌中的Hsp25表达水平正常，而基因敲除型(KO)小鼠心肌中的Hsp25表达水平与之相比明显下降。 3 Hsp25基因敲除后，不影响小鼠的正常发育以及生殖功能。 4小鼠MI后，在统计的两周时间内WT小鼠的存活率在75％，而KO小鼠与之相比，其存活率明显下降，并且在造模后的五天时间内全部死亡，尸体解剖发现90％的小鼠是因为心脏破裂而死。 5 MI后1天和3天的心功能追踪显示，KO小鼠心功能较WT小鼠显著降低。 6通过对MI后1天后3天的心脏梗死区的的细胞外基质研究发现，KO小鼠的Ⅰ型和Ⅲ型胶原较WT小鼠在蛋白水平有明显下降。 7通过对MI后1天后的心脏梗死区的的细胞外基质研究发现，KO小鼠的基质金属酶(matrix metalloproteinases，MMP)2和9较WT小鼠在蛋白水平有明显升高。 结论 Hsp25基因对于心肌梗死的创伤修复存在保护作用，该作用与调节细胞外机制重塑有关。

目录

声明

英文缩写和略语

摘要

第一部分：实验部分

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：综述 MMPs研究进展

1 MMPs的分子结构和分类

2 MMPs的抑制剂

3 MMPs与疾病

4 总结

参考文献

研究生期间发表的文章

致谢