基于Real--time PCR方法建立Escherichia coli O157:H7生长预测模型

摘要

大肠杆菌O157∶H7是食品中最常见的食源性致病菌，该菌致病性强、致死率较高，应引起高度重视。目前，利用微生物预测模型来描述和预测食品中微生物动态变化已成为监控微生物的有效手段。预测微生物模型能够在不进行传统平板计数检测的条件下，对食品的质量和安全做出快速评估和实时监控，确保食品安全。目前已建立的模型数据库主要有ComBase、PMP、FSP等，但这些模型主要通过传统平板培养方法获得基础数据，该方法操作繁琐、耗时耗力，且特异性和灵敏性均不强。相比之下，Real-time PCR因其特异性强、灵敏性高且定量准确、操作简便等特点，备受国内外学者青睐。目前，基于Real-time PCR方法建立微生物预测模型较少报道。因此，本论文以大肠杆菌O157∶H7为研究对象，首先建立大肠杆菌O157∶H7的Real-time PCR快速检测技术，并运用该技术建立大肠杆菌O157∶H7不同温度条件下的生长动力学模型，与传统计数方法建立的模型比较，分析该方法建立模型的可行性和可靠性。具体内容和结果如下: 1、建立大肠杆菌O157∶H7基于DNA的Real-time PCR快速检测方法，通过特异性、灵敏性和定量线性范围等参数评价方法的可行性。结果表明:该方法特异性强，选择大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因的特异性引物对肉中常见致病菌和腐败菌未见扩增;菌液检测的灵敏度可达到101 cfu/mL;该方法快速简便，可在6h内完成样品的定量检测。同时，与传统平板计数方法比较定量检测结果，发现两种方法之间无显著性差异。说明基于DNA的Real-time PCR方法可快速准确地对大肠杆菌O157∶H7进行定量检测。 2、运用Real-time PCR方法建立大肠杆菌O157∶H7不同温度(10、15、20、25、30℃)条件下的初级生长模型，包括修正Gompertz、Logistic模型，两种模型均能很好拟合两种计数方法得到大肠杆菌O157∶H7在不同温度条件下生长曲线，每条曲线存在明显的迟滞期、对数期和稳定期，且温度对微生物的生长速率和迟滞期有很明显的影响，生长速率随温度升高显著增大，迟滞期随温度升高明显缩短。通过相关系数(R2)、均方根误差(MSE)、偏差因子(Bf)和准确因子(Af)等评估模型的准确性，R2基本上≥0.99; MSE值均小于0.1 logcfu/mL，模型拟合程度较好。偏差因子Bf值和准确因子Af值均在可接受的范围内，模型准确性较高。通过与传统平板培养计数得到的预测模型进行比较，运用Real-time PCR方法建立的模型与传统方法建立模型无明显差别，能够较好地预测大肠杆菌O157∶H7的生长情况，解决了传统预测模型耗时耗力等问题。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 绪论

1 大肠杆菌O157∶H7

1．1 生物学特性

1．2 流行病学研究

2 Real-time PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的研究进展

2．1 Real-time PCR技术概述

2．2 Real-time PCR在大肠杆菌O157∶H7检测中应用

3 食品预测微生物学

3．1 微生物预测模型

3．2 微生物预测模型及其在食品工业中的应用

3．3 预测微生物模型研究进展

4 存在问题和本研究的意义

第二章 Real-time PCR检测大肠杆菌O157∶H7的研究

1 材料与方法

1．1 菌种

1．2 试剂与仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 Real-time PCR方法的确立

3 讨论

4 本章小结

第三章 运用Real-time PCR法建立大肠杆菌O157∶H7的生长动力学模型

1 材料与方法

1．1 菌种

1．2 试剂与仪器

1．3 试验方法

1．4 初级生长模型

1．5 模型评估

2 结果与分析

2．1 Real-time PCR法和传统平板计数法得到生长数据的比较与拟合

2．2 模型评估及不同模型拟合生长曲线的比较

3 讨论

4 本章小结

全文结论

论文创新点

展望

参考文献

致谢