噻虫嗪降解菌粘着箭菌Ensifer adhaerens CGMCC6315的根际促生特性及其降解噻虫啉的研究

摘要

噻虫嗪(Thiamethoxam，THIA)是第二代新烟碱类杀虫剂，不仅可以有效防治刺吸式害虫，还能促进植物合成激素、提高植株活力、增加农作物产量。其机制是由于THIA能诱导与植物生长相关的酶的合成以及THIA的某些代谢产物具有植物激素的作用。本实验室在筛选THIA降解菌时，发现THIA能够促进固氮菌粘着箭菌Ensiferadhaerens CGMCC6315的生长。由于植物根际促生菌(PGPR)同样可以促进植物生长和矿物吸收，抑制有害微生物，提高作物活力及产量，因此作者所在实验室推测THIA可以通过影响PGPR的功能间接地提高植物活力。本论文在上述研究的基础上继续研究E.adhaerens CGMCC6315的根际促生特性和THIA对其根际促生活性的影响，并研究了E.adhaerens CGMCC6315降解其他烟碱类杀虫剂。 根际促生特性实验显示E.adhaerens CGMCC6315分泌吲哚乙酸(IAA)，胞外多糖(EPS)，水杨酸(SA)和2，3-二羟基苯甲酸(DHBA)，产量分别为8.2±0.5μg/mL、5.7±0.3 mg/mL、6.9±1.1μg/mL、0.48±0.06μg/mL;E.adhaerens CGMCC6315能分泌氢氰酸(HCN)并且在蛋白胨水中产生氨化反应。E.adhaerens CGMCC6315具有固氮能力，通过巢式PCR(Nest-PCR)克隆得到两种类型固氮基因NifH，分别命名为NifH-3(JX081993)和NifH-4(JX081994),NifH-4与Ensifer sp.TJ170(AJ505315)相似度为100％，而NifH-3则和蓝藻Calothrix sp.MCC-3A相似度为98％。接种E.adhaerens CGMCC6315于黄豆根部不能促进根瘤的形成。THIA具有明显的水杨酸分泌促进能力，10 mg/L THIA可将SA的分泌量由6.9±1.1μg/mL提高到11.3±1.5μg/mL。在NaCl浓度为10 mmol、50 mmol、154 mmol盐胁迫条件下E.adhaerensCGMCC6315能够将黄豆发芽率分别提高14％，21％和30％。 E.adhaerens CGMCC6315可降解氰基亚氨基烟碱类杀虫剂噻虫啉(Thiacloprid，THI)，其静息细胞在10d内可降解83.3％的THI，LC-MS分析显示，其降解过程中生成酰胺噻虫啉(THI amide)。采用简并引物克隆法从CGMCC6315基因组上克隆到到部分腈水合酶序列1224 bp，包含全部α亚基642 bp，部分β亚基564 bp。 THIA不但可用于土壤施用，还可用于种子包衣。为提高植株苗活力，THIA通常与PGPR混合使用。由于大多数PGPR对农药较为敏感，因此筛选具有THIA耐受性的PGPR有一定的应用价值。本论文开展了与E.adhaerens CGMCC6315一起富集到的细菌Achromobacter sp.TMX-5、Microbacterium sp.TMX-6、Mesorhizobium alhagiTMX-36、Agromyces mediolanus TMX-25、Pseudoxanthomonas mexicana TMX-26 THIA耐受性及PGPR特性研究。5株菌虽然不降解THIA，但对200 mg/L的THIA具有耐受性。5株菌均具有分泌EPS的能力，分泌量在1.0±0.0 mg/mL到3.1±0.3 mg/mL之间，其中M.alhagi TMX-36的分泌量最大，为3.1±0.3 mg/mL，P.mexicana TMX-26的分泌量最小，为1.0±0.0 mg/mL;5株菌均可分泌SA和DHBA，SA最大分泌量为24.0±1.0 mg/L，最少为4.8±0.5 mg/L; DHBA最大分泌量为0.9±0.04 mg/L，最少为0.3±0.03 mg/L;A.mediolanus TMX-25分泌IAA，分泌量为16.0±1.2 mg/L。 综上所述，6株细菌均具有PGPR特性，E.adhaerens CGMCC6315和A.mediolanus TMX-25分泌IAA，E.adhaerens CGMCC6315和M.alhagi TMX-36具有固氮能力，并且6株细菌均可耐受200 mg/L THIA，THIA可促进E.adhaerens CGMCC6315的生长，并且对SA的分泌具有明显促进作用，在NaCl胁迫下接种E.adhaerensCGMCC6315可提高黄豆发芽率。

目录

声明

摘要

缩写

第一章 前言

一、烟碱类杀虫剂概述

1、烟碱类杀虫剂

2、THIA概述

3、THI概述

二、PGPR概述

三、腈水合酶概述

四、本文研究思路

第二章 E．adhaerens CGMCC 6315根际促生特性研究

1、材料和方法

1．1 实验器材和试剂

1．2 培养基

1．3 实验菌株

1．4 实验方法

2、实验结果

2．1 THIA对E．adhaerens CGMCC 6315 PGPR特性的影响

2．2 固氮特性

2．3 接种E．adhaerens CGMCC 6315对黄豆发芽及结瘤的影响

3、讨论

第三章 E．adhaerens CGMCC 6315降解噻虫啉和克隆腈水合酶基因的研究

第一节 噻虫啉的降解

1、材料和方法

2、实验结果

3、讨论

第二节 腈水合酶基因克隆

1、材料和方法

2、实验结果

3、讨论

第四章 土壤浸提液中筛选到的五株细菌的根际促生特性研究

1、材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2、实验结果

2．1 五株细菌对200 mg／LTHIA的耐受性

2．2 五株细菌的根际促生特性

2．3 THIA对Achromobacter sp．TMX-5、Microbacterium sp．TMX-6、M．alhagi TMX-36、A．mediolanus TMX-25 PGPR特性的影响

3、讨论

参考文献

本文的创新与不足

科研成果

附1：E．adhaerens CGMCC 6315腈水合酶序列

附2：E．adhaerens CGMCC 6315固氮基因NifH-3

附3：E．adhaerens CGMCC 6315固氮基因NifH-4

致谢