粟酒裂殖酵母中SpDJ-1,Hsp3101-Hsp3105的转录水平及其调控途径的研究

摘要

丙酮醛(CH3COCHO，MG)代谢异常与人类的许多疾病有关，如:糖尿病、神经退行性疾病（帕金森病和阿尔兹海默症）。近年来发现了一种不依赖于谷胱甘肽(GSH)就可以降解MG的乙二醛酶——乙二醛酶Ⅲ(GLO3)。在不同的生物体中，这种新型的乙二醛酶活性一般存在于DJ-1/Hsp31蛋白中。根据序列分析，D J-1和Hsp31是属于DJ-1/Hsp31/PfpI超家族的不同的两个亚家族。Hsp31在真菌中广泛存在，DJ-1只在部分真菌中存在，真菌中的Hsp31从细菌的Hsp31进化而来，而DJ-1从细菌的YajL进化而来并且在一些真菌中发生丢失。很多物种中GLO3都被鉴定出来，如大肠杆菌中的EcHsp31、白色念珠菌中的GLX3和人中的HsDJ-1。
　　粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe，S.pombe）中有1个DJ-1蛋白—SpDJ—1(SPAC22E12.03c)和5个Hsp31蛋白—Hsp3101(SPCC757.03c)、Hsp3102(SPAC5H10.02c)、Hsp3103(SPBC947.09)、Hsp3104(SPAC11D3.13)和Hsp3105(SPAC1 F7.06)（简写为Hsp3101-Hsp3105）。它们都是GLO3的同源蛋白。本实验组已鉴定出SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102具有GLO3活性。但目前还不知道S.pombe中GLO3同源蛋白基因的转录水平及其调控途径。本文系统探究了SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平及其调控途径，并研究了在MG刺激情况下，具有GLO3活性的SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102的表达情况和调控途径。
　　S.pombe中，SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105这6个基因的转录水平在稳定期时升高，说明它们发挥作用的时期最可能是在稳定期。SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录依赖蛋白激酶Spc1/Sty1，在⊿spc1菌株中SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平在稳定期时不出现上升现象。转录因子Atf1是Spc1的主要作用底物。这6个转录依赖Spc1的基因中，只有部分基因的转录也依赖Atf1，这些基因包括:SpDJ-1、Hsp3101、Hsp3102和Hsp3105。Hsp3103和Hsp3104的转录只依赖Spcl不依赖Atf1。SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录不依赖转录因子Pap1。
　　SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102具有GLO3活性。在MG刺激的情况下，这三个基因并没有增加表达量来应对MG。说明在应对MG刺激的情况下SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102并没有发挥明显作用，这3个蛋白在稳定期的高表达可能并不是用来降解MG而是具有其他作用。与野生型菌株在MG刺激的情况下相比，⊿ pap1菌株在MG刺激的情况下，SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102的转录水平没有变化。说明在MG刺激条件下，SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102的转录也不依赖Pap1。
　　本论文的创新点在于阐明和揭示了SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp310的转录水平及其依赖的调控途径，并且提示了SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102的主要功能并不是降解MG。本研究为人类及其他物种中GLO3的表达及调控提供了部分理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 生物体内丙酮醛降解途径的研究进展

1．1 丙酮醛对细胞的毒害作用

1．2 丙酮醛降解途径

2 乙二醛酶Ⅲ的研究进展

2．1 具有乙二醛酶Ⅲ活性的DJ-1蛋白

2．2 具有乙二醛酶Ⅲ活性的Hsp31蛋白

3 Spc1途径／Pap1途径参与应激的研究进展

3．1 Pap1途径参与应激

3．2 Spc1途径参与应激

3．3 Spc1途径／Pap1途径与丙酮醛

4 粟酒裂殖酵母研究背景简介

第二章 粟酒裂殖酵母spc1敲除突变株和atf1敲除突变株的构建

1 材料与方法

1．1 菌种、质粒与培养条件

1．2 试剂与仪器

1．3 引物设计

1．4 获取融合片段

1．5 栗酒裂殖酵母的醋酸锂转化

1．6 敲除菌株的鉴定

2 实验结果

2．1 spc1敲除菌株的获得

2．2 atf1敲除菌株的获得

3 讨论

第三章 粟酒裂殖酵母spc1敲除突变株pap1敲除突变株生长状况及细胞形态的研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 野生型及突变株酵母细胞生长曲线及存活率的测定

1．3 野生型及突变株酵母细胞形态的观察

2 结果

2．1 spc1基因敲除和pap1基因敲除对细胞生长曲线及存活率的影响

2．2 spc1基因敲除pap1基因敲除对细胞形态的影响

3 讨论

第四章 SpDJ-1、Hsp3101-Hsp3105各时期转录水平以及是否受Spc1-Atf1途径和Pap1途径调控的研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 粟酒裂殖酵母yHL6381总RNA的提取

1．3 RNA的质量检测

1．4 cDNA的获得

1．5 Real-Time PCR

1．6 荧光定量PCR引物设计

1．7 Real-Time PCR数据分析

1．8 酵母细胞蛋白的提取

1．9 蛋白浓度测定(BCA法)

1．10 Western Blot

2 结果

2．1 RNA的质量检测

2．2 WT菌株各生长时期SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平

2．3 Δspc1菌株各生长时期SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平

2．4 Δatf1菌株各生长时期SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平

2．5 Δpap1菌株各生长时期SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105的转录水平

2．6 与WT菌株相比，Δspc1、Δatf1、Δpap1菌株稳定期时Hsp3101蛋白水平的变化

3 讨论

第五章 MG刺激对SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102的表达及其调控的研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 MG刺激不同的酵母细胞

1．3 RNA的提取

1．4 cDNA的获得

1．5 Real-Time PCR

1．6 Real-Time PCR数据分析

1．7 酵母细胞蛋白的提取

1．8 蛋白浓度测定(BCA法)

1．9 Western Blot

2 结果

2．1 Δglo1突变株中SpDJ-1以及Hsp3101-Hsp3105各生长时期转录水平

2．2 MG对SpDJ-1、Hsp3101和Hsp3102转录水平的影响

2．3 MG对SpDJ-1和Hsp3101蛋白水平的影响

3 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢