粟酒裂殖酵母中人DJ-1同源基因的表达与转录调控研究

摘要

微生物在自然生存状态下，要面对波动的或突然改变的环境条件，如pH、温度、营养物、潜在的有毒物质、不同类型的射线、过量重金属、氧化物和环境激素类化合物。为了生存和繁殖，对于不同的外界环境压力，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）会及时的、有针对性的启动相应的基因转录和表达以应对外界环境刺激。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activaled protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能响应各种胞外和胞内刺激从而被激活，在多种生理反应过程中发挥关键性作用，包括增殖、分化、转化、炎症以及凋亡等。它存在于真核生物的大多数细胞内，从酵母到人类该信号通路都非常保守。在S.pombe中存在三种MAP Kinase信号通路，其中压力激活的Sty1信号通路在多种环境胁迫中被激活，比如渗透压、氧化应激、热激或者氮饥饿，调控多种环境刺激情况下基因的表达。
　　DJ-1基因广泛存在于真核生物当中，是一种新的丝裂原依赖的癌基因，该基因表达的蛋白在肿瘤生成、氧自由基的清除和调控雄激素受体等方面都具有重要作用。在S.pombe中，与人DJ-1同源性最高蛋白是SpDJ-1(SPAC22E12.03c)，同源性较远的5个蛋白是Hsp3101(SPCC757.03C)、Hsp3102(SPAC5H10.02C)、Hsp3103(SPBC947.09)、Hsp3104(SPAC11D3.13)、Hsp3105(SPCC1F7.06)且SpDJ-1已经被证实有乙二醛酶Ⅲ(GLO3)活性，说明酵母中的DJ-1参与过氧化物的代谢即在氧化应激下发挥作用。
　　本文在前人的基础上，以粟酒裂殖酵母为模式生物，探究了SpDJ-1的表达与转录调控机制。首先，敲除SpDJ-1和hsp3105以后酵母菌株在稳态期的活菌数显著下降，而敲除hsp3101-04以后菌株的稳态期却提前到来;其次证明了SpDJ-1受到Sty1蛋白的调控而不是Pap1;最后，确定了SpDJ-1基因的转录起始位点与TATA-BOX的位置，并通过生物信息学和测lacZ报告基因的方法，尝试分析了SpDJ-1上游启动子调控元件的位置。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 模式生物——粟酒裂殖酵母

1．2 MAPK级联信号途径

1．3 酵母对氧化物刺激的反应

1．4 DJ-1基因的研究进展

1．5 课题内容和展望

第二章 敲除菌的构建与制备抗体

2．1 材料与培养基

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 培养基与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 原核高表达Hsp3101重组蛋白并制作抗体

2．2．3 hsp3102-3105基因组原位加标签实验

2．2．4 敲基因方法

2．3 实验结果

2．3．1 原核表达质粒pET28a-hsp3101构建

2．3．2 重组Hsp3101蛋白的原棱表达

2．3．3 SpDJ-1及其同源基因原位加myc标签

2．3．4 人DJ-1同源基因的敲除

2．4 实验讨论

第三章 DJ-1同源基因的表达与转录调控研究

3．1 材料与培养基

3．1．1 菌种与质粒

3．1．2 培养基与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 本章所用到的引物

3．2．2 酵母存活率测定

3．2．3 酵母蛋白提取

3．2．4 ECL-western blot检测SpDJ-1及其同源基因的表达水平

3．2．5 S．pombe总RNA提取

3．2．6 SpDJ-1转录起始位点测定

3．2．7 融合PCR方法构建SpDJ-1上游启动子截短质粒

3．2．8 绘制标准曲线

3．2．9 报告基因lacZ酶活检测

3．3 实验结果

3．3．1 SpDJ-1及Hsp3101的表达水平检测

3．3．2 SpDJ-1及其同源基因敲除菌的生长表型

3．3．3 SpDJ-1受到Sty1信号通路的调控

3．3．4 SpDJ-1转录起始位点检测

3．3．5 信息学分析spDJ-1启动子的上游顺式作用元件

3．3．6 实验分析SpDJ-1启动子的上游顺式作用元件

3．4 结果讨论

全文总结

参考文献

硕士期间发表的成果

致谢