2型糖尿病及其微血管并发症患者血清microRNA表达谱筛选及临床价值研究

摘要

目的:筛选2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM）及其微血管并发症(Type2 diabetes mellitus microvascular complications，T2DMC)患者特异变化血清微小核糖核酸(microRNA，miRNA)表达谱，评价其对T2DM及T2DMC的诊断、鉴别诊断和病情监控临床价值。
　　方法:收集2013年9月～2014年5月间南京军区总院内分泌科收治的新发或一个月内未经任何治疗的T2DM及T2DMC各87例，同时收集同期在医院体检中心年龄、性别完全匹配的健康体检者87例做为正常对照。首先采用高通量、高灵敏度的低密度芯片技术（TaqMan Low Density Array, TLDA）对T2DM、T2DMC及健康对照各25例样本分别组成的混合血清中768种miRNA的表达水平进行检测，初筛T2DM和T2DMC特异变化的一组血清miRNA;然后运用准确的实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)对初筛miRNA在TLDA所使用的同一批样本中进行复筛（复筛组）;进一步运用qRT-PCR技术在另外三组T2DM、T2DMC和健康对照各62例样本中对复筛结果进行验证（验证组），筛选T2DM及T2DMC患者血清中稳定变化的一组miRNA。同时，运用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定全部患者及对照血清样本中氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化脂蛋白(a)[ox-Lp(a)]、β2糖蛋白氧化低密度脂蛋白复合物(β2-GPI-ox-LDL)和β2糖蛋白脂蛋白(a)复合物[β2-GPI-Lp(a)]的水平，运用Spearman秩相关分析和逻辑回归分析患者特异变化血清miRNA与上述脂蛋白、临床指标相关性及是否为T2DM及T2DMC独立危险因素。
　　结果:TLDA结果显示，T2DM及T2DMC患者血清miRNA表达谱与健康对照相比具有明显差异，53种miRNA在T2DM及T2DMC患者血清中较对照组表达上升，117种miRNA在患者表达下降。结合TLDA初筛及文献调查结果，我们选取了12种miRNA在复筛组样本中进行复筛，发现8种miRNA，包括miR-571、miR-661、miR-1303、miR-152、miR-1323、miR-892b、miR-770-5p和miR-886-3p水平在两组患者血清中显著上升，其中在T2DMC患者中变化更为显著（变化倍数＞2，P＜0.05）;8种miRNA在验证组中变化趋势与复筛组一致（变化倍数＞2，P＜0.05）;ROC曲线分析显示，8种血清miRNA对T2DM诊断的ROC曲线下面积(AUC)在0.774～0.877之间，对T2DMC诊断的ROC曲线下面积在0.823～0.946之间，对T2DM和T2DMC鉴别诊断的ROC曲线下面积在0.611～0.675之间。根据选定的cutoff值，8种血清miRNA对T2DM诊断的灵敏性和特异性分别在68.2％～88.1％和63.0％～84.5％之间;对T2DMC诊断的灵敏性和特异性分别在64.8％～84.7％和80.6％～98.6％之间;进一步分析上述miRNA的鉴别诊断价值显示，3种miRNA对T2DM和T2DMC的鉴别诊断具一定临床价值，其AUC、灵敏性和特异性分别为:miR-886-3p(AUC=0.675，灵敏性=0.651，特异性=0.628)、miR-892b（AUC=0.639，灵敏性=0.662，特异性=0.622）和miR-571(AUC=0.611，灵敏性=0.603，特异性=0.608)。ELISA结果显示，T2DM和T2DMC患者ox-LDL、ox-Lp(a)、β2-GPI-ox-LDL、β2-GPI-Lp(a)水平亦显著高于健康对照组（P均＜0.05）。Spearman秩相关分析显示，T2DM和T2DMC患者变化的8种血清miRNA与空腹血糖(fasting blood-glucose，FPG)、ox-LDL、ox-Lp(a)呈显著正相关（P均＜0.05）。单因素逻辑回归分析显示，8种血清miRNA、氧化脂蛋白及其复合物均为预测T2DM和T2DMC患者发病的独立危险因素;进一步多因素分析结果显示，在排除性别、年龄等影响因素后，miR-770、miR-661和甘油三酯仍是两组患者独立危险因素。
　　结论:8种血清包括miR-571、miR-661、miR-1303、miR-152、miR-1323、miR-892b、miR-770-5p和miR-886-3p在T2DM和T2DMC患者患者中显著上调，有望作为T2DM及T2DMC的辅助诊断标志物。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 2型糖尿病及其微血管并发症

1．2 微小核糖核酸背景介绍

1．2．1 微小核糖核酸的发现

1．2．2 miRNA的形成及其生物学功能

1．3 miRNA与T2DM及T2DMC之间的关系

1．3．1 miRNA与T2DM的关系

1．3．2 miRNA与T2DMC的关系

1．4 血清miRNA与T2DM及其微血管并发症

1．4．1 血清miRNA与T2DM的关系

1．4．2 血清miRNA作为糖尿病微血管并发症的生物标志物

1．5 血清氧化脂蛋白与2型糖尿病

第2章 T2DM及其并发症患者特异血清miRNA表达谱的筛选

2．1 实验材料与方法

2．1．1 研究对象和样本收集

2．1．2 主要仪器及试剂

2．1．3 血清低密度芯片技术检测

2．1．4 血清miRNA的定量分析检测

2．1．5 血清氧化脂蛋白的测定

2．1．6 数据分析与统计

2．2 实验结果

2．2．1 血清miRNA的低密度芯片初筛

2．2．2 血清miRNA的复筛

2．2．3 血清特异miRNA的大批量样本验证

2．2．4 ROC曲线分析

2．2．6 T2DM及T2DMC患者血清氧化脂蛋白的测定

2．2．5 T2DM及T2DMC患者血清miRNA与脂蛋白和血糖的相关性分析

2．2．6 T2DM和T2DMC危险因素分析

2．3 讨论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢