基于石墨烯荧光淬灭作用的DNA甲基化及生物小分子分析方法的研究

摘要

随着医疗技术的提高，癌症等恶性疾病的死亡率逐渐降低，癌症等不再是不治之症。而实现各种疾病的早期诊断和治疗则是提高疾病患者生存率的关键。通过对基因与癌症等基因相关的疾病的了解，从分子水平分析实现对各类疾病的早期诊断与治疗具有重要的意义。荧光分析法是一种常用的分析检测方法，具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点。而各类荧光材料（如石墨烯和石墨烯量子点）的发展使荧光传感器检测手段、检测效果、应用领域得到了显著的提高和拓展。本文旨在基于石墨烯类材料特殊的荧光性能实现疾病DNA和生物小分子的荧光分析，为某些疾病的早期诊断和治疗观察提供快速、灵敏、精确的方法。本论文主要以DNA甲基化、去甲基化引起的恶性疾病基因和高铁血红素为研究对象，实现DNA甲基转移酶、去甲基化的分析以及高铁血红素的荧光分析方法。主要内容如下:
　　1、我们建立了一种基于氧化石墨烯荧光淬灭作用的DNA甲基转移酶活性的分析方法。该方法中使用了一种包括与GO作用的结合区域和与目标DNA杂交的感应区域的特殊单链DNA探针。单链探针吸附于GO表面，与目标DNA杂交经限制性内切酶HpaⅡ剪切后，FAM离开GO表面进入溶液，荧光信号恢复。然而，双链被M.SssⅠ甲基化后HpaⅡ无法剪切，荧光信号无明显恢复且荧光信号恢复程度与M.SssⅠ浓度有关。实验结果表明，FAM的荧光强度变化值与M.SssⅠ浓度对数值在0.1 U/mL到100 U/mL范围内具有良好的线性关系，信噪比为3时最低检测限为（0.03±0.01）U/mL。并且，该方法能灵敏地识别其它甲基转移酶，具有良好的选择性。该方法可避免由于非特异性吸附干扰物而产生虚假信号，且能有效用于MTase抑制剂的评估和筛选，有望用于抗癌药物的发现。
　　2、我们发展了一种基于MBD2去甲基酶和限制性内切酶HpaⅡ相互作用体系来检测特定CpG位点的DNA去甲基化，并且建立一种基于氧化石墨烯荧光淬灭作用分析MBD2的方法。实验结果表明:MBD2检测范围可达到0.2-300ng/mL，最低检测限是（0.05±0.01）ng/mL(S/N=3)。该方法对MBD2活性分析具有良好的灵敏性和选择性，并可用于复杂体系对DNA去甲基酶的检测，有望成为检测DNA去甲基水平的重要传感方法，对生物医学研究和早期临床诊断等具有重要的参考价值。
　　3、我们通过电化学方法合成硼掺杂石墨烯量子点(BGQDs)，并成功将其应用于高铁血红素(Hematin)的检测。根据高铁血红素对BGQDs的高效荧光淬灭能力，可直接分析人类红细胞中高铁血红素含量。其创新性在于本方法不仅可以实现高铁血红素的高灵敏、高选择性分析，而且本方法可直接分析红细胞中高铁血红素含量，避免了其它方法必须先分离血红蛋白等操作。在0.01-0.92μmol/L范围内，高铁血红素浓度和荧光强度具有良好的线性关系，其最低检测限为（0.005±0.001）μmol/L(S/N=3)。此外，本方法可用于健康型和镰刀型红细胞中高铁血红素含量的分析。结果表明，健康型和镰刀型红细胞中高铁血红素浓度分别是（23.1±4.9）μmol/L和（52.5土9.5）μmol/L。我们还结合电化学方法和DFT模拟计算研究了高铁血红素对BGQDs的荧光淬灭机理，从理论上阐明了本方法的可行性。该方法可实现红细胞中高铁血红素直接、快速、灵敏、选择性的分析，且无需标记、操作简单、成本低廉，对临床检查和疾病诊断等具有潜在的应用价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 石墨烯

1．2．1 石墨烯概述

1．2．2 石墨烯的制备

1．2．3 石墨烯功能化

1．2．4 石墨烯在生物领域的应用

1．3 石墨烯量子点

1．3．1 石墨烯量子点概述

1．3．2 石墨烯量子点的制备

1．3．3 石墨烯量子点的应用

1．4 指导思想

第二章 基于GO荧光淬灭作用的甲基转移酶活性的分析及抑制剂的筛选

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 GO的制备

2．2．3 MTase活性分析

2．2．4 M．SssI选择性分析

2．2．5 抑癌药物的筛选

2．3 结果与讨论

2．3．1 GO荧光淬灭能力分析

2．3．2 M．SssI活性分析

2．3．3 选择性研究

2．3．4 抑癌药物的筛选

2．4 结论

第三章 GO荧光淬灭能力结合限制性内切酶分析DNA去甲基酶活性

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 GO的制备

3．2．3 DNA去甲基酶活性分析

3．2．4 MBD2选择性分析

3．2．5 细胞培养和提取物的制备

3．3 结果与讨论

3．3．1 GO荧光淬灭能力分析

3．3．2 去甲基化条件优化

3．3．3 MBD2活性分析

3．3．4 选择性分析

3．4 结论

第四章 BGQDs的制备及在分析红细胞中高铁血红素的应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 BGQDs的制备

4．2．2 仪器

4．2．3 电化学检测

4．2．4 荧光检测

4．2．5 红细胞溶出物的制备

4．2．6 理论计算

4．3 结果与讨论

4．3．1 BGQDs的表征及性质研究

4．3．2 BGQDs检测高铁血红素

4．3．3 选择性分析

4．3．4 高铁血红素对BGQDs荧光响应机理研究

4．3．5 实际检测

4．4 结论

第五章 结论和展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

研究生期间的研究成果

致谢