氯化铵和过氧化氢以及γ-氨基丁酸对卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwelli)种群动态和抗氧化系统的影响

摘要

轮虫是淡水水体重要的浮游动物类群，由于对环境变化相当敏感，因此常被用于研究环境变化对水域生态的指示生物。本文中我们选取了卜氏晶囊轮虫（Asplanchna brightwelli）作为试验材料，研究了氯化铵、过氧化氢和γ-氨基丁酸对卜氏晶囊轮虫种群动态和抗氧化系统的影响。并进一步克隆了卜氏晶囊轮虫CAT基因的全长，利用Real time quantitative PCR检测了不同氧化剂下线粒体MnSOD，细胞质MnSOD与HSP70，CAT基因的mRNA表达量之间的关系。尝试从传统生态学与分子生态学两个方面研究氧化剂对卜氏晶囊轮虫抗氧化系统的影响。研究结果如下:
　　1.NH4Cl、H2O2急性毒理实验(LC50)
　　采用单“克隆”培养的卜氏晶囊轮虫作为起始材料，研究两种氧化剂对轮虫的急性毒性实验。氯化铵对卜氏晶囊轮虫的24hLC50为83.5203 mg/L，回归方程为Y=3.7042X-2.1189(R2=0.8997)，95％置信限为47.2003～147.7882mg/L;过氧化氢对卜氏晶囊轮虫的24hLC50为0.0628mM，直线回归方程为Y=6.785x+13.158(R2=0.9364)，95％置信限为0.0415～0.0949mM。本结果表明:氯化铵和过氧化氢胁迫下，对卜氏晶囊轮虫表现出明显的毒性效应，其死亡率随着药物浓度的增加而上升。可见，卜氏晶囊轮虫作为受试动物，可以比较精确地评估两种药物的毒性作用。
　　2.NH4Cl、H2O2对轮虫生命表参数影响
　　氯化铵和过氧化氢胁迫下，卜氏晶囊轮虫净生殖率（R0）、世代时间(T)和内禀增长率(rm)结果显示:
　　低浓度氯化铵(5.00 mg/L)对轮虫的生命表动态影响不显著(P＞0.05)，但高浓度处理组（10.00、20.00和40.00 mg/L），除了10.00 mg/L处理组的世代时间与对照组相比无显著变化外，其他各处理组的R0、T、rm和对照组相比都显著下降(P＜0.05)。这表明:从10.00mg/L开始，氯化铵对轮虫已经有了明显的毒性效应。
　　不同浓度的过氧化氢（0.01、0.02、0.04和0.08 mM）处理下，在0.01 mM浓度组时，R0和对照组相比显著降低(P＜0.05)，其他指标无显著影响。0.02 mM处理组的T和对照组相比显著降低(P＜0.05)，其他指标无显著影响。当浓度为0.04、0.08 mM时，R0、T、rm与对照组比均显著下降(P＜0.05)。说明过氧化氢浓度高于0.04 mM时，对轮虫具有明显的毒性效应。
　　3.γ-氨基丁酸(GABA)对卜氏晶囊轮虫种群增长的影响
　　添加0.5，5.0和50μg/mlγ-氨基丁酸(GABA)，轮虫的种群数量与对照组在1d和2d时无显著差异(P＞0.05)，第3d，4d，5d时均有显著差异(P＜0.05)。其中50μg/ml GABA添加组轮虫密度最高（78.67±3.56）。而500 g/ml GABA处理组与对照组相比没有显著差异。50μg/ml GABA可以在一定程度上促进卜氏晶囊轮虫的种群增长(P＜0.05)，而其他浓度对轮虫的种群增长无显著影响(P＞0.05)。
　　4.克隆卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwelli)的CAT基因
　　卜氏晶囊轮虫AspCAT基因全长1556bp，能够编码503个氨基酸。翻译的蛋白分子量为56.9020kDa，理论等电点7.05。化学分子式为C2537H3890N716O750S15。带负电荷的残基(Asp+Glu)为61个，带正电荷的残基为（Arg+Lys）60个。用SignalP software(ExPASy)预测未发现信号肽序列，说明卜氏晶囊轮虫CAT是一种胞内蛋白。AspCAT序列全长在NCBI同源比对后显示其属于CAT基因家族。
　　5.NH4Cl、H2O2对卜氏晶囊轮虫抗氧化酶(CAT，HSP70，MnSODs)表达的影响
　　氯化铵和过氧化氢处理12和24h时，CAT，HSP70，MnSODs的表达量普遍上调，和对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。我们推断是由于轮虫细胞对氧化应激做出了相应的反应，刺激抗氧化相关酶的表达。
　　氯化铵和过氧化氢处理36和48h时，CAT，HSP70，MnSODs的表达量普遍下调，和对照组相比有显著下降。我们推断是由于轮虫细胞的氧化系统已经损伤，相关抗氧化酶表达受阻。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 轮虫

1．1．1 轮虫简述

1．1．2 卜氏晶囊轮虫基本的基本特征

1．2 轮虫的生态学研究进展

1．2．1 轮虫作为毒理学受试动物的优势

1．2．2 轮虫作为毒理学受试动物的研究历史

1．2．3 轮虫应用于生态毒理学的指标参数

1．3 轮虫相关分子生物学研究进展

1．3．1 轮虫分子生物学研究概况

1．3．2 轮虫抗氧化作用研究

1．4 γ-氨基丁酸

1．5 氨氮胁迫和过氧化氢的毒理学研究基础

1．5．1 氮在环境中的循环途径

1．5．2 氨氮

第2章 过氧化氢和氯化铵对卜氏晶囊轮虫的急性毒理效应

2．1 材料与方法

2．1．1 轮虫的采集、培养

2．1．2 实验药品的配置

2．1．3 轮虫的实验培养

2．1．4 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 氯化铵对卜氏晶囊轮虫的急性毒性效应

2．2．2 过氧化氢对卜氏晶囊轮虫的急性毒性效应

2．3 讨论

第3章 氯化铵和过氧化氢对卜氏晶囊轮虫种群动态的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 轮虫的采集与培养

3．1．2 主要实验仪器

3．1．3 实验药品的配置

3．1．4 轮虫的实验培养

3．1．5 观测参数与计算方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论

第4章 γ-氨基丁酸(GABA)对卜氏晶囊轮虫种群增长的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验设计

4．2 结果

4．3 讨论

4．3．1 轮虫种群增长的影响因素

4．3．2 GABA对轮虫种群增长的调控

第5章 卜氏晶囊轮虫CAT基因克隆和特征分析

5．1 材料与方法

5．1．1 主要实验仪器

5．1．2 轮虫总RNA的提取(Trizol法)

5．1．3 RNA质量测定

5．1．4 RNA逆转录

5．1．5 目的基因兼并引物设计

5．1．6 目的基因PCR扩增

5．1．7 目的基因PCR产物的割胶回收

5．1．8 连接PMDTM-19T载体

5．1．9 菌液PCR验证

5．1．10 测序比对

5．1．11 cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增基因全长

5．1．12 目的基因生物信息学分析

5．1．13 构建系统进化树

5．2 结果与分析

5．2．1 AspCAT核苷酸序列分析

5．2．2 CAT多重序列比对

5．2．3 AspCAT遗传距离和系统进化树

5．3 CAT三级结构预测

5．4 讨论

第6章 氯化铵和过氧化氢对卜氏晶囊轮虫抗氧化酶(CAT，HSP70，MnSODs)表达影响的研究

6．1 材料与方法

6．1．1 主要实验仪器

6．1．2 荧光定量PCR

6．1．3 实验设计

6．1．4 数据分析

6．2 结果与分析

6．3 讨论

小结与展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢