Stathmin1基因表达对微管药物抑制细胞增殖作用的影响

摘要

Stathmin1(STMN1)是一种在脊椎动物细胞中普遍存在的胞质可溶性磷蛋白，含有149个氨基酸，分子量为19KD。在细胞有丝分裂的不同阶段，Stathmin1蛋白通过其磷酸化和去磷酸化状态的转变调节活性，能够直接与微管结合，加速微管解聚和重组装的过程，或与游离微管蛋白结合来阻止微管的聚合过程，从而对细胞微管动态系统的调节发挥重要的作用，继而能够高效的调节细胞的增殖和分化。继阿霉素和顺铂后，紫杉醇是最炙手可热的抗癌药物，目前研究发现，紫杉醇在多种肿瘤治疗中起作用，如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等。紫杉醇药物作用的靶位点是细胞骨架的微管系统，可以结合在β-微管蛋白N-端第31位氨基酸及217至231位氨基酸上，结合后可促进微管蛋白聚合并稳定微管结构，抑制其解聚，进而影响微管聚合与解聚的动态平衡，导致有丝分裂纺锤体形成受阻，从而使微管排列异常而形成稳定的非功能性微管束，将细胞周期阻断于G2/M期，最终促使细胞生长抑制和凋亡。除紫杉醇外，一种新型的抗癌药物去氧鬼臼毒素(DPPT)最近几年也引起了研究者的关注。去氧鬼臼毒素能够结合微管蛋白上的秋水仙素位点，抑制微管的聚合，从而使细胞周期阻滞在G2/M期，起到抗肿瘤的效果。
　　本研究以正常小鼠的成肌细胞C2C12为实验材料，用两种抗肿瘤药物紫杉醇和DPPT分别处理C2C12细胞48h后，对其进行形态观察，并通过MTT方法检测存活率，分别提取相应总蛋白和总RNA，进一步对其在给药后Stathmin1基因以及蛋白表达水平进行检测，初步探讨了两种抗肿瘤药物对正常细胞增殖的影响。结果显示，随着药物浓度的升高，细胞的存活率大致呈马鞍形，即低浓度0.1μM和高浓度100μM的DPPT药物处理后细胞存活率较高，分别为70.6％和97.9％;低浓度0.1μM和高浓度100μM的紫杉醇药物处理后细胞存活率分别为53.7％和98.7％。只有在一定浓度范围内时，随着药物浓度的增加，细胞的存活率降低。不同点在于，DPPT药物在浓度为1μM时，细胞存活率达到最低值为55.8％;而紫杉醇在药物浓度为0.5μM时，细胞存活率达到最低值为39.1％。在药效方面，总的来说，DPPT与紫杉醇相比，DPPT处理细胞时，细胞的死亡率小于紫杉醇处理细胞的死亡率;不同浓度的DPPT和紫杉醇分别处理C2C1248h后，通过Western Blot检测细胞STMN1的表达水平，在药物浓度为0.5μM时，Stathmin1蛋白表达水平相对于对照组来说分别降低70.6％和77.9％。随着药物浓度增加，Stathmin1蛋白表达水平反而有所增加。细胞STMN1的mRNA相对表达水平经逆转录PCR检测后显示，在药物DPPT浓度为0.1μM时，mRNA相对表达水平降低了60.6％，在药物紫杉醇浓度为0.5μM时，mRNA相对表达水平降低了79.9％，之后随着药物浓度的增加，STMN1的mRNA相对表达水平出现一定上升趋势。综上所述，紫杉醇和DPPT的抗癌作用与细胞STMN1表达水平有着密切的联系。
　　本研究以人肺腺癌细胞A549为实验材料，利用RNA干扰技术，成功地构建了人Stathmin1 shRNA干扰表达载体，重组干扰质粒分别命名为STMN1/hshRNA1、STMN1/hshRNA2和STMN1/hshRNA3，采用脂质体转染人肺腺癌细胞A549，通过检测人Stathmin1 shRNA干扰质粒对细胞中Stathmin1表达水平的下调作用来计算出干扰效率，通过转染干扰质粒后的人肺腺癌细胞A549细胞的迁移水平的变化来探讨人Stathmin1基因表达水平与细胞迁移的相关性。Western Blot检测结果显示，STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干扰质粒使A549细胞中Stathmin1蛋白表达水平分别降低了82.2％和78.4％，RT-PCR检测结果显示，STMN1 mRNA的表达水平分别降低了59.1％和54.7％。由此可知，STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干扰质粒的构建，能有效干扰Stathmin1的表达。细胞迁移实验结果显示，相比于转染阴性对照质粒的A549细胞的迁移率，转染干扰质粒STMN1/hshRNA1的细胞迁移率在8h和16h时分别显著降低了63.2％和55.8％，转染干扰质粒STMN1/hshRNA3分别显著降低了72.2％和62.4％。由此说明，STMN1的表达水平的降低，可以明显降低人肺腺癌细胞A549的迁移率。探讨了Stathmin1干扰和药物联合作用对人肺腺癌细胞A549细胞存活率的影响。结果数据表示，0.5μM紫杉醇和去氧鬼臼毒素作用A549细胞时细胞存活率分别为28.5％和45.8％，然而STMN1/hshRNA1干扰与0.5μM紫杉醇、DPPT联合作用A549细胞时，细胞存活率降低至21.2％和32.4％;STMN1/hshRNA3干扰与0.5μM紫杉醇、DPPT联合作用A549细胞时，细胞存活率降低至27.2％和31.7％，因此，联合作用可以降低肿瘤药物的用量。

目录

声明

摘要

第一章 综述

第一节 紫杉醇和DPPT(去氧鬼臼毒素)两种药物与微管的关系

1．1 紫杉醇与微管组装的关系

1．2 DPPT(去氧鬼臼毒素)与微管组装的关系

第二节 Stathmin1基因及其功能

2．1 Stathmin1基因

2．2 Stathmin1蛋白

2．3 Stathmin1蛋白与细胞周期

2．4 Stathmin1蛋白与肿瘤

2．5 Stathmin1蛋白与肿瘤生物治疗

2．6 Stathmin1蛋白在肿瘤生物治疗中的研究现状

第三节 RNA干扰技术的研究进展

第四节 Stathmin1 shRNA干扰和药物联合处理效果的研究

第二章 DPPT(去氧鬼臼毒素)药物对C2C12细胞Stathmin1表达水平的影响

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂和耗材

2．2．3 主要溶剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后观察细胞形态的变化

2．3．2 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后测定细胞存活率

2．3．3 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后总蛋白提取

2．3．4 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后总RNA提取

2．3．5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)

2．3．6 逆转录PCR(RT-PCR)

2．3．7 数据处理与统计

2．4 实验结果

2．4．1 DPPT药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12形态的影响

2．4．2 紫杉醇药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12形态的影响

2．4．3 两种药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12存活率的影响

2．4．4 两种药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12 Stathmin1的表达水平影响

2．4．5 低浓度紫杉醇(0．1μM)诱导小鼠成肌细胞系C2C12分化

2．4．6 Stathmin1 shRNA干扰质粒通过转染小鼠成肌细胞系C2C12检测干扰效率

2．5 讨论

第三章 人Stathmin1基因干扰对人肺腺癌细胞A549迁移的影响

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 实验菌株、质粒和细胞

3．2．3 主要耗材和试剂

3．2．4 主要溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 人Starhmin1 shRNA载体的构建

3．3．2 人Stathmin1 shRNA干扰效率的鉴定

3．3．3 划痕实验检测人Stathmin1 shRNA对人肺腺癌细胞A549迁移的影响

3．3．4 数据处理与统计

3．4 实验结果

3．4．1 选取合适的RNA干扰片段并且设计shRNA的引物序列

3．4．2 人Stathmin1 shRNA载体的构建及建立

3．4．3 人Stathmin1 shRNA干扰质粒转染A549检测干扰效率

3．4．4 人Stathmin1 shRNA对人肺腺癌细胞A549迁移的影响

3．4．5 人Stathmin1 shRNA干扰质粒通过转染SGC7901检测干扰效率

3．5 讨论

第四章 Stathmin1基因干扰与药物联合作用对人肺腺癌细胞A549的影响

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂和耗材

4．2．3 主要溶液配制

4．3 实验方法

4．3．1 人肺腺癌细胞A549的培养和转染

4．3．2 MTT法检测细胞的存活率

4．3．3 数据处理与统计

4．4 实验结果

4．4．1 Stathmin1干扰与药物联合作用对A549及SGC7901细胞存活率影响

4．5 讨论

全文总结

本研究主要结论

存在问题与后续研究打算

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢